N_离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌
离子束诱变筛选SG^r和ara^-双突变肌苷高产菌
离子束诱变筛选SG^r和ara^-双突变肌苷高产菌刘国生;吴飞燕;赵婷;王秀强;李宗义【期刊名称】《中国医药工业杂志》【年(卷),期】2009()5【摘要】以枯草芽孢杆菌HSD060为出发菌株,注入不同剂量N^+离子束,定向筛选磺胺胍抗性(SG^r)或阿拉伯糖利用缺陷株(ara^-)单突变株,复筛得到产量提高显著的单突变株B13(SG^r)和B67(ara^-),肌苷的摇瓶发酵产量分别比出发菌株提高16.3%和20%。
注入剂量为3×10^(15)ions/cm^2时,SG^r突变率较高:1×10^(16)ions/cm^2时,ara^-突变率较高;且发生SG^r突变的频率高于ara^-突变。
再次以最适剂量分别对B13、B67菌株进行离子束诱变,筛选SG^r和ara双突变菌株,经复筛得到产量显著提高的双突变株B13-105、B13-5和B67-1,平均肌苷发酵产量比相应的单突变株分别提高23.5%、20.4%和23.1%。
【总页数】3页(P338-340)【关键词】肌苷;枯草芽胞杆菌;N^+离子束;磺胺胍抗性;阿拉伯糖利用缺陷【作者】刘国生;吴飞燕;赵婷;王秀强;李宗义【作者单位】河南师范大学生命科学学院;新乡拓新生化科技有限公司;河南省离子束生物工程重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.阿魏菇多糖高产菌株筛选的离子束诱变和复合诱变对比研究 [J], 王连峰;陈恒雷;张军;曾宪贤2.结合缺陷型菌株显色法采用离子束诱变筛选高产L-精氨酸突变株 [J], 杨娟;饶志明;徐美娟;夏海锋;窦文芳;许正宏3.小球藻等离子束诱变高产菌筛选 [J], 刘秀花;梁梁;陈仲达;张淑红;宋兆齐;王莉;梁峰4.L—苹果酸产生菌筛选及高产突变株诱变选育 [J], 吴清平;周小燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大肠杆菌诱变处理与营养缺陷型筛选
大肠杆菌诱变处理与营养缺陷型筛选【实验目的】1.了解应用物理、化学因素对细菌进行诱变的方法。
2.初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的技术。
【实验原理】在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，可诱发基因突变。
如果突变后丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长，称为营养缺陷型。
实验室获得营养缺陷型菌株通过经过以下几个步骤：诱变处理、突变型筛选、缺陷型检出，缺陷型鉴定。
诱变处理首先要选择诱变剂，诱变剂可分为物理和化学两类。
微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
进行诱变处理时为了避免出现不纯的菌落，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀。
试验表明处于对数生长期的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
诱变处理必须选择合适的剂量，不同微生物的最适处理剂量不同，须经预备实验确定。
物理诱变的相对剂量与三个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源(紫外灯)功率、处理时间，往往通过处理时间控制诱变剂量。
化学诱变剂的剂量也常以相对剂量表示。
相对剂量与三个因素有关：诱变剂浓度、处理温度和处理时间。
一般通过处理时间来控制剂量，在处理前对诱变剂和菌液分别预热，当二者混合后即可计算处理时间，可精确控制处理剂量。
经处理以后的细菌，缺陷型所占的比例还是相当小，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，浓缩缺陷型细胞。
浓缩缺陷型的方法有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法等，这些方法适用于不同的微生物。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法，青霉素是杀菌剂，只杀死生长细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能生长，可被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明：把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变与筛选 山大微生物大实验
山东大学实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选作者：姚健(201000140136)同组者：刘新强指导老师：林建群(教授)实验日期：2013年5月22日-6月1日微生物大实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命基地班姚健 201000140136摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria.关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening1引言筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
物技术、微生物代谢等领域的研究中均具有重要作用，另外它还是研究基因的结构与功能的常用材料。该研
究以大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5α为实验材料，利用紫外线（UV）对其进行诱变，并且采用青霉素法浓
缩营养缺陷型细菌，采用逐个测定法检出营养缺陷型，利用生长谱法对缺陷型菌株进行鉴定、分析，得到了 4
株稳定的营养缺陷型突变株，分别为赖氨酸、组氨酸、精氨酸和嘧啶营养缺陷型菌株。
关键词：大肠杆菌；营养缺陷型；紫外诱变
中图分类号 Q311
文献标识码 A
文章编号 1007-7731（2016）15-0033-03
Study on Selection of Auxotrophic Strain of Escherichia coli by UV Mutation
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2016，22（15）
33
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
宁 祎 李基丽 道吉吉 王春台 刘新琼*
（中南民族大学生命科学学院，湖北武汉 430074）
摘 要：营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。营养缺陷型菌株在遗传学、食品生
Ning Yi et al. （College of Life Science，South-central University For Nationalities，Wuhan 430074，China） Abstract：The auxotrophic strain，which is caused by the gene mutation，is a kind of mutant strain of biochemistry. It plays an mportant role in the study of genetics，food biotechnology，microbial metabolism，and so on，besides， the auxotrophic strain has been always used to study the structure and function of genes. The steps of screening are inducing mutation，after culturing，eliminating the wild types，detecting the deficit types and identifying the deficit types.The ultraviole（t UV）was used to mutate the strain of Escherichia coli—DH5α，and then by the use of penicil⁃ lin method，the auxotrophic bacteria were concentrated and tested respectively to find out the auxotroph.Finally，the auxotrophies were identified and analyzed by growth chart of nutritional need，and four auxotrophic strains were suc⁃ cessfully obtained. Key words：Escherichia coli；Auxotrophy；UV-induced mutation
N +离子注入诱变选育高效降酚菌的研究
筛选到 ｌ ２株假丝 酵母 及丝 抱酵 母 ， 以苯 酚 为唯 一 能
碳源生 长 ，４ｈ～ ｈ内降解 苯酚 质量浓 度最高 可达 ２ ２８ １ ０ ｇ Ｌ以上 。周群英 等 人从 焦化 废水 中筛 选 ０ｍ ／ ２ 出了 ｌ ２株高温 降酚菌株 ， 在温 度为 ６ ６ ０ｃ ｃ～ ８ｃ ， ｃ下
促进作 用 。
关键词 ： 含酚废水； Ｎ 离子； 诱变； 微生物 中 图分 类 号 ：７３ Ｘ ０
文 献 标 识 码 ： Ａ
文 章编 号 ：０７７４ （０６ ０ － ３ － １０－１６ ２０ ）６ ６ ８ ５ ０ ０
Ｂｒ ｅ ｆＰｈｅ ｏ － ｅ ｒ ｄ ｎｇ Ｍ ｉ ｒ ｏ ｇ ｎｉｍ ｉｈ Ｎ Ｉ ｎ ｎ ｅｄ ｏ ｎ ｌｄ ｇ ａ ｉ ｃ ｏ ｒ ａ ｓ ｗ ｔ ｏ Ｉ ｄｕｃ ｄ Ｍ ｕｔ ｔｏ ｅ ａ ｉ ｎ
ｓｉ ｂ ｏ ｃｎｒｔ ｎｏ ｐ ｌ ｎａ ａｂｎｓｕｃ Ｇｕｏｅ ａ ｒｍ ｔ ｔｅｇ ｗｈａｄ ｐ ｅｏ ｄ ｇａｉｇｒｔ ｏ ｕ ａｌ ｃｎｅｔ ｉ ｆ ｕ ｐｅ ｔｒ ｃｒｏ ｏ ｒｅ（ ｌｃｓ ）ｃｎｐ ｏｅ ｈ ｒｔ ｎ ｈ ｎｌ ｅｒｄｎ ａ ｆ ｔ ｅ ａｏ ｓ ｍｅ ｙ ｏ ｏ ｅ
含 酚量为 １ ０ ｇ Ｌ的情 况下进 行实验 研究 ， ０ｍ ／ ０ 历时 ４
成 为工业废 水处 理方面 急 待解 决 的 问题 之 一 。利 用 微 生物 降解 酚 的研 究 ， 国 内外 已有 不 少 报道 ｌ７， 在 １］ －
杨彦希 等从炼 油厂严 重污染 的污水 和土壤 中分离
ＰＡＮ Ｇ ｉｏ— ｕ Ｘ ａ ｋ ｎ， Ｃ ＡＯ Ｄｅ ，Ｈ ＵＡ Ｒｉｍａｏ —
（ ｏ ｅｅ ｏ Ｒ ｓ ｕｃ ｎ ｎ ｉ ｎ ｅ ｔ ｅ ａ ｒＡ ｒ ｕｔｒｌ ｒｄ ｃ Ｓ ｌ ｙｏ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｅ ｏ ｒｅａ ｄＥ ｖｒ ｍ ｎ ，Ｋ ｙ Ｌ ｂｆ ｇ ｃ ｌ ａ Ｐ ｏ ｕ ｔ ａ ｔ ｆ ｌ ｏ ｏ ｉ ｕ
低能N^+离子注入诱变选育云芝高产抗病菌株的研究
１ ． ２ ．质体悬液（ １ ０ ＂ ￣ ＇ ／ ｍ Ｌ ）
涂布于无菌平 皿中央 ， 于 超 净 工 作 台 中 快 速 涂 匀 风 干后 立 即
进行低能 Ｎ 离子 注入。 １ ． ２ ． １ ． ２ 低能 Ｎ 离 子 注 入 离 子 注 人 前 ， Ｌ Ｚ Ｄ 一 ９ ０ ０ 型 离 子 注
息
龟蚪 １ 苗
２ ０ １ ４ （ ２ ）
低能Ｎ 离 子 注 入 诱 变 选 育 云 芝 高 产 抗 病 菌 株 的 研 究
种
化 瓣
摘 要 应 用 低 能 Ｎ 离 子 注 入 筛 选 所 得 高 产 抗 病 融 合 云 芝 菌 株
蒋 益 ‘ 郑 惠 华。 刘广 建 全 卫丰 ‘ 薛 臻 季 宏更 汪 洁
入机开 机预热 ２ ｈ ， 用 紫外线对靶 室持续消毒 ３ ０ ｍｉ ｎ ， 调 节 靶
室真空 度为 ｌ ０ 。Ｐ ａ ， 注入物质 Ｎ 离 子提前加 速到 ２ ０ Ｋ ｅ Ｖ， 后
文章 编 号 １ ０ ０ ０ — ８ ３ ５ ７ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ２ — ０ ０ １ ８ － ０ ３
液体 发酵 生物量及同体栽培子 实体 转化率 、 对病菌 平均 抗性水
平 为初筛 和复筛标准 ． 经遗传稳 定性实 验验证 ， 筛 选 到 了 一 株 云 芝 高产 抗 病 菌 株 ， 其子实体产量较对照菌株提 高了 １ ０ ． ３ ％， 抗 病水 平提高 了 ５ ％。 结 果 表 明 ： 低能 Ｎ 离 子 束 注 入 是 一 种 较 为 理 想 的 云芝 诱 变 育种 手 段 。 关键词 云芝 低能 Ｎ ＋ 离子 诱 变 育 种
１ ． ２ ． ２ 原生质体存活量统计 离子注入后用 ｌ ｍＬ ０ ． ６ Ｍ 蔗 糖
微生物诱变育种技术——离子注入法
此外还有涂 孢法和培养法 . 涂孢法是将稀释 的菌体或孢子悬液涂
布 于 合 适 的 琼 脂 平 皿 上 , 量 减 少 细 胞 重 叠 , 于 离 子 注 入 机靶 室 . 尽 置 抽 真 空 进 行 离 子 注 入 ; 养 法 是 将 菌 悬 液 接 种 于 培 养 基 平 皿 上 . 长 出 培 待
无 无 离 子 注入 诱 变 育 种 技 术 是 近 些 年 发 展 起 来 的 物 理 诱 变 技 术 . 技 等 初 步 研 究 了 无 菌 水 , 菌 水 生 理 盐 水 , 菌 脱 脂 奶 保 护 剂 对 菌 膜 该 发 但 起 术 以 较 小 的生 理 损 伤 得 到 较 高 的 突 变 率 , 广 的 突 变 谱 , 且 具 有 设 菌 株活 性 的影 响 , 现 保 护 剂 保 护 作 用 强 , 是 影 响 离子 注 入 , 到 能 较 而 无 备 简单 , 用 方 便 , 本 低 廉 , 使 成 对人 体 和 环 境 无 害 等 优 点 口 尤 其 在 微 生 量反 射 和屏 蔽 作 用 ; 菌 生 理 盐 水 对 菌 株 的活 性 保 留 最 大 . 这 方 面 研 l , 物 诱 变 育 种 的研 究 中 , 用 离 子 注 入 进 行 菌 种 改 良已 在 生 产 实 践 中得 究 需 要 进 一 步 确 定 保 护 剂 , 求 离 子 注 入 时 活 菌 细胞 最 多 . 利 力 另 外 . , +A ~ 子 是 常用 的诱 变 剂 , 中 N最 常 用 . 注 入 能 量 H十N , r 离 其 到 广 泛 应 用 . 为 2 ky 3 k y 注入 剂 量 0对 照卜 1 o/r2 间 , 冲 式 注 入 , 次 0 e一 0 e . ( 06ne 之 i a 脉 每 1离 子 注 入 法 的作 用机 理 . 离子 注入法是利用离子 注入设 备产生高能离子束(0 6 kv并注 连 续 注 入 的 时 间 和 间 隔 时 间 因 处 理 的 种 类 不 同 而 各 异 ,温 度 应 控 制 4—0e) 0 真 03 1 p 针 入 生物 体 引起 遗 传 物 质 的永 久 改 变 , 后 从 变 异 菌 株 中 选 育 优 良菌 株 5 ℃ 以下 , 空 度 为 1 - d . .这 只是 常用 量 , 对 不 同菌 种 要 进 行 然
采用低能N离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法[发明专利]
![采用低能N离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b295078d561252d381eb6e66.png)
专利名称：采用低能N离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法
专利类型：发明专利
发明人：路福平,杜连祥,张敏,王海宽,李玉,王春霞,王建玲,吴雅倩
申请号：CN200710150281.9
申请日：20071122
公开号：CN101182513A
公开日：
20080521
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种采用低能N离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法，其步骤是(1)筛分出发菌株；(2)N离子注入诱变；(3)筛选高产菌株；(4)N离子注入诱变；(5)中性蛋白酶高产菌株的确定。
本发明利用N离子注入技术对产生中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌AS1.398进行诱变，并经不同剂量的N离子注入后，菌株的存活率呈典型的“马鞍型”剂量－效应曲线，可在最佳注射剂量
50×10ions/cm下筛选到一株具有良好遗传稳定性的高产突变菌株，其中性蛋白酶的摇瓶活力在8230U/mL左右，较出发菌株提高了81.3％。
在离子注入技术能够应用于中性蛋白酶高产菌株的诱变选育中，对微生物来说具有较高的突变率和较宽的突变谱，诱变效果好，是一种比较理想的微生物菌种选育方法。
申请人：天津科技大学
地址：300457 天津市经济技术开发区第十三大街29号
国籍：CN
代理机构：天津盛理知识产权代理有限公司
代理人：王来佳
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化学与生物工程2011,Vol.28N o.4Ch emistry &B ioengin eerin g49基金项目:中国科学院等离子体物理研究所暨安徽省离子束生物工程学重点实验室开放基金资助项目(2009年度)收稿日期:2011-02-16作者简介:昌国强(1985-),男,湖南人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学;通讯作者:欧伶,副教授。
E mail:spartancgq@ho 。
doi:10.3969/j.issn.1672-5425.2011.04.014N +离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌昌国强1,欧 伶1,丁庆豹1,郑之明2,王 丽2,袁成凌2(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2.中国科学院等离子体物理研究所离子束生物工程学重点实验室,安徽合肥230031)摘 要:利用N +离子注入诱变大肠杆菌,经甲氧苄啶的选择性筛选,得到胸腺嘧啶营养缺陷型菌株。
通过重组DN A 技术将该突变株胸苷酸合成酶(T S)基因连接到载体pM D 18T 质粒上,经测序发现T S 基因第173个碱基由AT CG ,其相应的氨基酸由谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58)。
该突变株的获得为后续研究嘧啶核苷酸的代谢奠定了基础。
关键词:低能N +离子注入;甲氧苄啶;胸苷酸合成酶中图分类号:Q 933 Q 691 文献标识码:A文章编号:1672-5425(2011)04-0049-04营养缺陷型菌株在工业微生物的设计育种、遗传学及医学等领域有着重要作用[1]。
不同的研究及实际应用常常需要获得某种特定营养缺陷型的突变株,然而特定营养缺陷型菌株的筛选十分困难,需要经过复杂的物理和化学诱变才能获得。
离子束注入技术是20世纪80年代中期研究出来的一种诱变技术[2]。
与其它诱变源相比,离子束注入诱变可以在轻度损伤的情况下,获得更高的突变率(较其它诱变高出1~2个数量级)和更广的突变谱,因此被广泛运用于各种生物细胞诱变选育的研究。
大肠杆菌(Escher ichia coli )的胸苷酸(dTM P)代谢途径[3]有两条:第一条为从头合成途径,即尿苷酸(UM P)经过一系列的代谢途径,最后形成脱氧尿苷单磷酸(dU MP),在胸苷酸合成酶(T S)的作用下生成脱氧胸苷单磷酸;另一条为补救途径,可以直接从体外吸收胸腺嘧啶或者胸腺嘧啶核苷来合成胸苷酸。
作者在此采用低能离子束注入法诱变大肠杆菌,并利用甲氧苄啶(TM P)[4]定向筛选,获得胸腺嘧啶(T)营养缺陷型的大肠杆菌突变菌株,再克隆出T 营养缺陷型菌株T S 基因[5],通过基因重组技术构建T 重组子,并测定其T S 基因序列,与正常大肠杆菌的TS 基因进行对比,以鉴定突变株T S 基因是否发生突变。
1 实验1.1 菌种、质粒和培养基E.coli DH 5 ,自行保存。
pM D 18T 载体,TAKARA 生物技术公司;E.coli BL21(DE3),No vagen 。
LB 液体培养基:蛋白胨10g L -1,酵母提取物5g L -1,NaCl 10g L -1,根据需要另加入终浓度100 g mL -1羧苄青霉素钠或50 g mL -1卡那霉素,固体培养时另加入17g L -1琼脂。
GS 培养基:(NH 4)2H PO 42.5g L -1,KH 2PO 41.5g L-1,NaCl 5.0g L-1,Mg SO 4 7H 2O (20%溶液)0.5mL L -1,谷氨酸钠3.0g L -1,葡萄糖3 0g L -1。
GST 培养基:(NH 4)2H PO 4 2.5g L -1,KH 2PO 41.5g L -1,NaCl 5.0g L -1,M gSO 4 7H 2O (20%溶液)0.5m L L -1,谷氨酸钠3.0g L -1,葡萄糖3.0g L -1,胸腺嘧啶50 g mL-1。
1.2 试剂与仪器DNA 聚合酶、dNTP 、限制性内切酶、T 4连接酶,TAKARA 生物技术公司;DNA 回收试剂盒,天根生物技术公司;琼脂糖、标准分子量DNA (DNA M ark er)、三羟甲基氨基甲烷(T ris),鼎国生物技术有限公司;低分子量标准蛋白(Pro tein m ar ker),中国科学院上海生化所;胰蛋白胨、酵母粉。
其它试剂均为国产分析纯。
Mini MJ型PCR仪,DYCP 31型水平电泳槽, 725型紫外光栅分光光度计,DY CZ 24D型电泳仪, GL 312型UV检测仪,JY92 型超声破碎仪,低能离子注入仪(中国科学院等离子体物理研究所)。
1.3 菌株的诱变1.3.1 菌悬液的制备将大肠杆菌BL21于LB液体培养基中培养至对数期,浓度约为1 108cfu m L-1。
取10m L发酵液离心得菌体,用0.01mo l L-1的磷酸缓冲溶液(PBS)重悬。
取0.1mL重悬菌液均匀涂布于无菌空白培养皿中,无菌风吹干或自然晾干后立即进行N+离子注入。
1.3.2 N+离子注入[6]将上述涂菌培养皿放入离子束注入靶室进行离子注入,注入能量为10keV,靶室真空度为0.001Pa,以8s脉冲式注入,间隔为5s,单次注入剂量为2.5 1013ions cm-2。
注入剂量( 2.5 1013ions cm-2)分别为5、10、15、20、25、30、40、60、100。
注入后立即用无菌缓冲溶液将培养皿上菌体冲洗下来。
以经过真空处理而不注入离子束的菌株作为对照。
1.3.3 诱变后处理将经离子束注入过的样品培养皿在无菌条件下用无菌PBS洗脱,收集洗脱液,经适当稀释后涂布于含胸腺嘧啶的LB培养皿,置于培养箱中于37 培养48 h后计数,计算存活率。
存活率=经N+离子注入处理的存活菌落数经真空处理的存活菌落数100%1.4 菌株的筛选1.4.1 T营养缺陷型菌株的浓缩将经离子束注入后的培养皿用PBS洗脱,取一定体积洗脱液,接种于含T的GS液体培养基培养一段时间,再加入一定浓度的甲氧苄啶(T MP),培养过夜,菌液离心后用PBS重悬。
1.4.2 T营养缺陷型菌株的筛选取200 L重悬菌液涂布于LB+T的培养皿上作为母板,置于培养箱中于37 培养24h,用平板影印法将母板上单菌落分别影印到GS+T+T MP培养皿及GS+TM P对照培养皿上,37 培养24h,将在GS +T MP培养皿上不生长、而在GS+T+T MP培养皿上生长的单菌落挑出,即为T营养缺陷型菌株。
将筛选出来的T营养缺陷型菌株保存在终浓度15%的甘油储存液中并置于-80 冰箱中保存备用。
1.4.3 T营养缺陷型菌株的鉴定为了进一步研究T营养缺陷型菌株的生理特性,掌握营养缺陷的代谢机理,推测作为胸苷酸途径代谢的限速酶 胸苷酸合成酶基因发生突变,导致该酶失活,这可能是营养缺陷的原因。
因此对该酶基因进行遗传学鉴定。
胸苷酸合成酶基因(T hy A)序列参见Gen bank[7]。
按文献[8]方法提取突变菌基因组,以其作为模板设计5 端引物GCTCT AGAA ATAAT T TT GT TT AACTT TAA G A A GGA G ATAT ACATA TGA AACA GT ATT T AG、3 端引物GGAA TT CT TA GAT AGCCACCGGCGCT TT AAT G,进行PCR扩增,下划线处分别为X ba 和Eco R 的酶切位点。
扩增条件为:95 预变性5min后,PCR循环:94 变性30s,60 退火45s,72 延伸60s,共30个循环;最后72 延伸10m in。
PCR产物的纯化按琼脂糖凝胶回收试剂盒说明进行。
将回收的目的基因与pM D 18T克隆载体连接,转化E.coli DH5 感受态细胞,涂布于含羧苄青霉素钠的LB平板上,过夜培养。
挑单克隆菌株TPM D1,提取质粒,进行限制性内切酶分析鉴定,如确定为阳性,进一步测定DNA序列。
1.4.4 DNA测序及序列分析DNA测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成,双向测序,确保测序的准确性。
序列分析由美国国立生物技术信息中心相应站点http://blast.nc /Blast.cgi在线完成,通过在线运行blastn和blastx,比对突变基因及其相对应的多肽序列,了解基因突变位点,并运用Discov ery studio分子模拟软件考察TS蛋白在突变前后的三维结构变化,研究其TS变异后失活原因。
2 结果与讨论2.1 N+离子注入对菌株存活率的影响(图1)由图1可知,在N+注入剂量小于15 2.5 1013 io ns cm-2时,随N+注入剂量的增加,菌株存活率迅速降低;当剂量达到15 2.5 1013io ns cm-2后,存活率有短暂的回升,后又逐渐下降,整个过程呈 马鞍型 变化曲线,注入剂量超过100 2.5 1013ions cm-2后存活率趋于零。
这可能是由于离子注入细胞的射程较短,离子束侵蚀细菌细胞表面,大量自由基在胞内堆积,破坏胞内活性大分子,使得细菌迅速死亡;但是当剂量增加到一定强度时,进入细菌体内的离子图1 N+离子注入对菌株存活率的影响Fig.1 The effect of N+ions implantation on cell survival rate会在菌体外形成一种库仑斥力,在胞外形成保护屏障,阻碍离子靠近菌体细胞,细菌存活率开始上升;但是剂量超过一定限度,细胞又会失去保护屏障,开始慢慢死亡。
因此,选择 鞍峰 位置剂量能获得最大突变率。
本实验选择最佳诱变注入剂量为20 2.5 1013io ns cm-2,此时,菌株的存活率约为25%。
2.2 甲氧苄啶对突变菌筛选的影响在筛选过程中为提高突变菌比例,需对诱变后的培养液进行适当浓缩处理。
目前常用的细菌浓缩法为青霉素浓缩法[9],但该方法不能定向选育,不方便后续的筛选工作。
本实验选用针对性更强的甲氧苄啶(T MP)作为筛选试剂。
四氢叶酸是胸苷酸合成酶催化dU M P生成dT MP的供甲基体,四氢叶酸的供应不足,胸苷酸合成酶就无法发挥其催化作用,胸苷酸的正常代谢途径中断,菌体无法自身合成胸苷酸,在无外源胸腺嘧啶时可导致细菌死亡。
TM P的作用是能与二氢叶酸还原酶发生不可逆结合,阻止体内四氢叶酸的生成,胸苷酸正常代谢途径受TM P的抑制作用,细菌无法正常生长。
而T营养缺陷型菌株则不受TM P的影响,当培养基中添加了T或者胸腺嘧啶核苷(TR)时,能摄取T或T R来合成胸苷酸,满足T营养缺陷型菌株正常的生长需求。
因此,T营养缺陷型菌株在含甲氧苄啶的GST培养基中能正常生长,而野生型菌株将会受到抑制。
通过测定T营养缺陷型突变菌株在有无TM P时光密度(有TM P时为OD600 ,无T MP时为OD600)的比值(OD600 /OD600),考察T M P浓度对菌株生长的影响,结果见图2。