营养缺陷型突变体的筛选及其应用
营养缺陷型菌株的筛选方法
营养缺陷型菌株的筛选方法
营养缺陷型菌株的筛选是一种重要的技术，主要应用于基因组学研究、菌种鉴定、病
原学研究及微生物资源保护。
营养缺陷型菌株是有针对性的，可作为正常菌株的突变体，
以提高实验在病原性、耐受性等方面的准确性。
因此，有效的筛选营养缺陷型菌株不容忽视。
营养缺陷型菌株的筛选包括实验法和非实验法两种。
实验法是采用固定条件，通过控
制外源营养物质完全缺乏或有限，使某一肽或多肽水平落到特定值，从而引起营养缺损型
菌株的筛选；非实验法则是依据基因数据库中发现的营养物质代谢路径分析，筛选出能够
诱导营养缺陷菌株的基因。
具体步骤如下：
1、构建营养培养基：根据需要，选择对营养缺陷型菌株的实验特异性的培养基，将
培养基进行稀释，以减少营养物质的含量。
2、处理营养缺陷型菌株：分离菌株，以营养缺陷型菌株为【测试菌】，无营养缺陷
的正常菌株为【对照菌株】。
3、培养对照菌株
将对照菌株接种于稀释的培养基中，摇匀，加热37℃翻转培养，室温培养12—18小时，待菌落出现，观察是否有正常菌落形成。
若有正常菌落出现，在16小时后再次观察，确定营养缺陷型菌株存在可能性。
5、数据分析：根据营养缺陷型菌株的表型分析结果，确定可能存在营养缺陷型菌株
的培养基形式，进行深入分析，以便更好地了解营养缺陷的突变机理。
营养缺陷型菌株的筛选是一项复杂的工作，仅依靠一种筛选方法是不够的，为了使筛
选更有效率和准确，应该综合使用上述多种筛选方法，全面分析各种可能的内因、外因对
营养缺陷型菌株发生的影响，以实现科学准确的筛选结果。
【资料】营养缺陷型突变体的筛选及其应用汇编
２淘汰野生菌的方法
• ２．２菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其 原理是在基本培养基中，野生型的孢子能 发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此 将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养 一段时间后，再进行过滤。
• 如此重复数次后，就可以除去大部分野生 型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的 目的。
３营养缺陷型的检出方法
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法
• 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
１）影印法
• 影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全 培养基表面上，经培养后长出菌落，然后 用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将 长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 而在后一培养基上的相应部位却没有，就 说明这是一个营养缺陷型菌落。
三种培养基的定义
• 在基本培养基中只是有针对性的加入某一 种或某几种自身不能合成的有机营养成分， 以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养 基，称为补充培养基(SM)。
营养缺陷型菌株筛选的一般方法
（1）诱变剂处理 • （2）淘汰野生型菌株 • ① 抗生素法 • ② 菌丝过滤法 • （3）检出营养缺陷型 • （4）鉴定营养缺陷型
２）夹层培养法
• 夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培 养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养 基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标 记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充 培养基)，再培养，这时再出现的新菌落， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果 有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中 挑出并不很容易。
细菌营养缺陷型的诱变和筛选
微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。
紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。
筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。
又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。
关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。
微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。
如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。
影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。
用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。
用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。
夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
营养缺陷型菌株的筛选过程
• 营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野 生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。
• １诱变剂处理
• 诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变 处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很 低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素 法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌 株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。
3营养缺陷型的检出方法夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法影印接种法影印接种法逐个检出法逐个检出法1影印法影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上经培养后长出菌落然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具将长出菌落的平皿倒转过来在丝绒上轻轻按一下转接到另一基本培养基平板上经培养后比较这两个平皿长出的菌落
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法 • 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
１）影印法
• 影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全 培养基表面上，经培养后长出菌落，然后 用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将 长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 而在后一培养基上的相应部位却没有，就 说明这是一个营养缺陷型菌落。
２）夹层培养法
• 夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培 养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养 基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标 记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充 培养基)，再培养，这时再出现的新菌落， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果 有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中 挑出并不很容易。
突变体筛选及其在基因功能研究中的应用
突变体筛选及其在基因功能研究中的应用突变体是指基因发生了变异，导致生物表型发生了变化的个体。
突变体的发现可以为基因功能研究提供重要的线索和工具。
因此，突变体筛选是基因功能研究中一个重要的环节。
一、突变体的筛选方法突变体的筛选方法可以从不同角度入手。
下面列举几种主要的方法：1. 单种系突变体筛选法：通过大量材料自然生长和自然选择，筛选出个体表现出某种性状变异的育种材料。
例如，为了研究水稻茎长度，可以通过大量材料的种植，筛选出茎长或短的个体，进而进行后续功能研究。
2. 化学诱变突变体筛选法：利用化学物质能够引起基因突变的特性进行筛选。
这种方法可以产生大量的突变体，但其中很多并不与所研究的性状相关，而且部分突变可能会影响整个基因组，造成结果不可靠。
3. 物理诱变突变体筛选法：利用高能射线、紫外线、电离辐射等物理因素来诱导基因突变。
这种方法产生的突变体数量少，但是比较可靠，因为突变基本上是点突变。
但是，物理突变体筛选方法的具体实践难度较大，而且容易造成其它性状的变异。
4. 基因突变体库筛选法：采用基因突变体库中的突变体作为研究对象。
这种方法适用于基因测序技术得到迅速发展时，可以通过对大规模的突变体库进行筛选来实现高通量的基因功能鉴定。
以上是突变体筛选的主要方法。
实际上，在进行筛选方法的选择时，需要考虑材料来源、筛选方法、筛选条件、突变频率、同型反应等多方面因素。
二、突变体的筛选原则1. 突变后表型鲜明：在进行突变体筛选时，需要注意筛选突变后表型明显、鲜明的材料，可易于识别和分辨。
2. 突变后表型稳定：筛选出表型突变的材料后，还需要验证其是否是稳定的突变，如果表型不稳定或在环境条件的影响下变化，则不能作为突变体进一步研究。
3. 突变与基因相关：筛选突变体时，必须确保该突变与所要研究的基因密切相关。
否则，虽然突变表型存在变异，但很可能与研究的基因没有关联。
三、突变体在基因功能研究中的应用突变体在基因功能研究中有着广泛的应用。
简述营养缺陷型菌株的筛选方法
简述营养缺陷型菌株的筛选方法营养缺陷型菌株是指在一定条件下，无法自主合成某些生物活性物质而需要外源性提供的菌株。
这类菌株在微生物研究和应用中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的营养缺陷型菌株的筛选方法。
1. 选择基质筛选法选择基质筛选法是一种简单直接的筛选方法。
首先，根据所需筛选菌株的营养缺陷特点，选择一种含有该营养物质的基质。
然后，将待筛选的菌株接种于这种基质上进行培养。
如果菌株能够生长、繁殖，说明其具有该营养物质的合成能力；如果菌株无法生长、繁殖，说明其存在该营养物质的缺陷。
通过这种方法可以初步筛选出营养缺陷型菌株。
2. 诱变筛选法诱变筛选法是通过诱变剂对菌株进行处理，使其发生突变，进而筛选出营养缺陷型菌株。
常用的诱变剂有化学物质和物理因素。
化学物质如亚硝酸钠、硝酸钠等，物理因素如紫外线、γ射线等，这些诱变剂能够引起菌株的DNA发生突变。
在诱变后，将菌株接种到无法自主合成某种生物活性物质的培养基上，观察其生长情况。
如果菌株能够生长、繁殖，说明其突变后具有该物质的合成能力丧失，从而可以筛选出营养缺陷型菌株。
3. 基因敲除筛选法基因敲除筛选法是通过遗传工程手段将特定基因从菌株中删除，以筛选出营养缺陷型菌株。
首先，通过PCR扩增的方法获得待敲除基因的DNA片段，并引入到质粒载体中。
然后，将质粒载体导入到目标菌株中，经过转化或转染等方式使其取得该质粒。
接下来，通过选择性培养基筛选，以抗生素等为筛选标记，筛选出已经发生基因敲除的菌株。
最后，通过基因测序等方法验证所得菌株中目标基因已经被成功敲除，从而得到营养缺陷型菌株。
4. 遗传重组筛选法遗传重组筛选法是通过基因重组技术将特定基因导入到菌株中，使其能够合成原本无法自主合成的物质。
首先，将目标基因与适当的表达载体连接，并经过酶切、连接等操作获得重组质粒。
然后，将重组质粒导入到宿主菌株中，使其取得重组质粒。
最后，通过选择性培养基等筛选方法，筛选出成功获得目标基因的菌株。
实验七营养缺陷型菌株的筛选优质文档
与营养要求有关的3种遗传型关系
培养基的基本概念 （按营养需求成分分）
与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养 基：
基本培养基（MM）：仅能满足某微生物的 野生型菌株生长所需要的最低成分的组合 培养基。——不同菌株的要求不同，此试 验要先确定，非常重要。
完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺 陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
本次实验利用紫外线进行诱变处理（主要是形成嘧啶二聚体，引起后续DNA复制错误，达到诱变的目的）。
实验培养基：肉汤液体培养基（CM） ；
养皿中。置于37℃恒温培养箱内，避光培养 第四步：鉴定营养缺陷型（此步因时间关系不再进行）
1、是作为研究代谢途径和遗传规律及育种技术不可少的标记菌种；
12小时以上。——诱变后DNA复制形成纯合 子过程。
注意紫外线防护（不要长时间暴露在其下）。
3、淘汰野生型，浓缩缺陷型 （第二天）
（1）吸5毫升紫外线处理过并重新培养的菌 液，放入已灭菌的15mL离心管，3500转/分 离心10分钟。
（2）倒去上清液，加入5mL生理盐水，打 散混匀沉淀，如此重复离心洗涤三次，加 生理盐水到原体积（5mL）。
补充培养基：凡只能满足相应的营养缺陷 突变株生长需要的组合或半组合培养基。
营养缺陷型的用途
营养缺陷型在生产上和科学研究上用途 很大，主要有两方面应用：
1、是作为研究代谢途径和遗传规律及 育种技术不可少的标记菌种；
2、可直接用于生产氨基酸、核苷酸等 代谢产物——目的在于切断某些代谢途径 以积累中间代谢产生或切断一条代谢途径 而积累另一分支途径的末端产生。 ——解除代谢途径中的反馈抑制和阻遏。
基本培养基（MM）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
三、实验过程
1 菌液制备：实验前14－16小时开始在肉汤 培养基中培养－离心取沉淀－用生理盐水 制成菌液。 2 诱变处理：将菌液置于培养皿中，紫外线 照射处理，再用肉汤培养基培养12小时。 3 青霉素淘汰野生型：离心洗涤洗去培养基 －制成菌液－无N培养12小时－在2N培养基 中用青霉素淘汰野生型－分别接入肉汤培 养基和基本培养基。实验十Biblioteka 大肠杆菌营养缺陷型 的筛选
一、实验原理
大肠杆菌因受到紫外线强烈照射而发生突 变，其中有一些突变类型是营养缺陷型， 通过特定的方法，可将有关的营养突变型 筛选出来。然后在通过对这些性氧缺陷型 进行营养生长谱法，可以鉴定有关突变的 营养缺陷种类。
实验材料
1 菌种：大肠杆菌K12SF+ 2 工具：培养皿，三角烧瓶，吸管，离心管 3 培养基：肉汤液体培养基，肉汤液体培养 基ZE，基本液体培养基，基本固体培养基， 无N基本液体培养基，2N基本液体培养基， 混合氨基酸，混合维生素和核酸 4 生理盐水
营养缺陷型的检出
1 取差异最大的一组，在完全培养基上选取 80个菌落，分别对应接种在完全培养基和基 本培养基上。 2 37℃培养12小时。 3 选在基本培养基上不长，完全培养基上生 长的菌落，即是营养缺陷型。
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２淘汰野生菌的方法
• ２．２菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其 菌丝过滤法 原理是在基本培养基中，野生型的孢子能 发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此 将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养 一段时间后，再进行过滤。 • 如此重复数次后，就可以除去大部分野生 型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的 目的。
• 其在研究和实践中都有极其重要的意义。 其在研究和实践中都有极其重要的意义。 它可作为研究代谢途径和杂交、转化、 它可作为研究代谢途径和杂交、转化、转 原生质体融合、 导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗 传规律所不可缺少的标记菌种； 传规律所不可缺少的标记菌种；也可作为 氨基酸、维生素、 氨基酸、维生素、碱基等物质生物测定的 实验菌种；在生产中，可直接用作发酵生 实验菌种；在生产中， 产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株； 产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株； 也可作为菌种杂交、 也可作为菌种杂交、重组育种和利用基因 工程进行育种时所不可缺少的带有特定基 因标记的亲本菌株。 因标记的养法是先在培养皿上倒一层基本培 养基， 养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养 凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 经培养后， 经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标 然后再倒上一薄层完全培养基(或补充 记，然后再倒上一薄层完全培养基 或补充 培养基)，再培养，这时再出现的新菌落， 培养基 ，再培养，这时再出现的新菌落， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果 有时不明确， 有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中 挑出并不很容易。 挑出并不很容易
４）限量补充培养法
• 限量补充培养法是将诱变处理后的细胞接 种在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培 养基上。野生型菌株就会迅速生长成较大 的菌落，而营养缺陷型菌株只能形成生长 缓慢的微小菌落，因而可以识别检出。如 果想得到某一特定缺陷型菌株，则可直接 在基本培养基上加入微量的相应物质。
营养缺陷型菌株的应用
培养基的类型
• • • • 按其营养成分分类 基本培养基 完全培养基 补充培养基
三种培养基的定义
• 凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分 的合成培养基，称为基本培养(MM)。在这 里我们称其变异前的菌株称为野生菌株。 • 在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维 生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如 蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷 型菌株生长繁殖的培养基，称为完全培养 基(CM) 。
２淘汰野生菌的方法
• ２．１抗生素法 抗生素法是利用野生型菌株能在MM 中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变 处理液在MM中培养短时让野生型生长，处 于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于 “休眠状态”，这时，加入一定量的抗生 素，结果活化状态的野生型就被杀死，保 存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以 用青霉素，酵母可用制霉菌素。
营养缺陷型菌株的筛选过程
• 营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野 生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。
• １诱变剂处理
• 诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变 处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很 低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素 法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌 株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。
三种培养基的定义
• 在基本培养基中只是有针对性的加入某一 种或某几种自身不能合成的有机营养成分， 以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养 基，称为补充培养基(SM)。
营养缺陷型菌株筛选的一般方法
（1）诱变剂处理 • （2）淘汰野生型菌株 • ① 抗生素法 • ② 菌丝过滤法 • （3）检出营养缺陷型 • （4）鉴定营养缺陷型
３）逐个检出法
• 逐个检出法是将经过诱变处理的细胞涂布 在完全培养基平板上，待长出单个菌落后， 在完全培养基平板上，待长出单个菌落后， 用接种针或牙签将这些单个菌落逐个依次 地分别接种到基本培养基和另一完全培养 基平板上。经培养后， 基平板上。经培养后，如果在完全培养基 上长出菌落， 上长出菌落，而在基本培养基上却不长菌 说明这是一个营养缺陷型菌株。 落，说明这是一个营养缺陷型菌株。
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
刘丹妹
生物工程L081班
E-mail：939800020@
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
• • • • • 主要内容： 一、营养缺陷型菌株的概念 二、培养基的类型 三、营养缺陷型菌株的筛选 四、营养缺陷型菌株的应用
营养缺陷型菌株的概念
• 在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的 筛选及应用有着十分重要的意义。 • 营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺 乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、 嘌呤和嘧啶碱基等)的能力，必须在其基本 培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正 常生长繁殖的变异菌株。
３营养缺陷型的检出方法
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法 • 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
１）影印法
• 影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全 培养基表面上，经培养后长出菌落， 培养基表面上，经培养后长出菌落，然后 用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具， 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将 长出菌落的平皿倒转过来， 长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 而在后一培养基上的相应部位却没有， 而在后一培养基上的相应部位却没有，就 说明这是一个营养缺陷型菌落。 说明这是一个营养缺陷型菌落。