拟南芥ems诱变与突变体筛选
拟南芥TMM新等位基因突变体tmm-6的筛选、鉴定及特征分析的开题报告
拟南芥TMM新等位基因突变体tmm-6的筛选、鉴定及特征分析的开题报告一、选题背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）是广泛应用于植物生物学和遗传学研究的模式植物。
TMM是拟南芥中一个重要的拟南芥叶毛发发育和维持基因。
tmm突变体在拟南芥幼苗时出现叶毛发的异常，以及在成体时叶毛发数量和分布的缺失。
因此，研究拟南芥TMM基因的突变体，对于理解拟南芥叶毛发发育的分子机制具有重要意义。
二、研究目的本研究旨在通过化学诱变方法筛选拟南芥TMM基因新等位基因突变体，鉴定突变体的功能和特征，探究拟南芥叶毛发发育的分子机制。
三、研究内容1. 化学诱变及筛选以拟南芥Col-0为材料，通过化学诱变方法筛选TMM新等位基因突变体。
对种子进行化学诱变后，筛选出表型发生明显变化的个体，如叶毛发的异常、叶片形态改变等。
2.鉴定突变体对筛选出的突变体进行表型鉴定以及后代分析，进一步鉴定其是否为TMM的新等位基因突变体。
利用PCR扩增方法对突变位点进行测序，确定突变位点。
3.特征分析对TMM突变体的生长发育、形态结构等进行分析，同时利用荧光原位杂交与RT-PCR技术分析突变体中TMM基因的表达情况。
研究突变后的拟南芥叶毛发的形态结构和数量分布。
四、预期结果1. 筛选出TMM的新等位基因突变体。
2. 对突变体进行鉴定，明确突变位点。
3. 对突变体进行特征分析，包括生长发育、形态结构、TMM基因表达情况以及叶毛发的形态结构和数量分布等方面的特征。
4. 探究TMM基因突变对拟南芥叶毛发发育的分子机制。
五、研究意义本研究通过突变筛选等方法，得到新的拟南芥TMM基因突变体，探究其功能特征，有助于深入了解拟南芥叶毛发的发育和维持机理。
通过对拟南芥基因的研究，还有助于揭示植物生长发育的分子机制，为揭示高等生物生长发育的分子机理提供理论基础。
拟南芥MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析(1)
植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００９， ４４ （１）： ５２−５８， ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期： ２００８－０６－２２； 接受日期： ２００８－０６－２６基金项目： 国家自然科学基金（Ｎｏ． ３０６２５００２和Ｎｏ． ３０６２８０１２）†共同第一作者。
＊ 通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ： ｑｕｌｊ＠ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．研究论文．拟南芥 ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析侯仙慧１†， 丁茂予１†， 刘赛男１， 李林川１， 瞿礼嘉１， ２＊１北京大学生命科学学院， 北京大学－耶鲁大学植物分子遗传和农业生物技术联合研究中心， 蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验室， 北京１００８７１； ２国家植物基因研究中心（北京）， 北京１００１０１摘要 生长素是最重要的植物激素之一， 参与了植物生长发育的各个方面。
植物体内游离的ＩＡＡ是生长素的主要活性形式，在ＩＡＡ甲基转移酶１（ＩＡＭＴ１）的作用下， ＩＡＡ可以转变为ＩＡＡ甲酯 （ＭｅＩＡＡ）。
ＭｅＩＡＡ本身没有活性， 在植物体内的ＭｅＩＡＡ酯解酶作用下可以重新转变为ＩＡＡ。
ＭｅＩＡＡ是非极性分子， 能够在植物体内自由扩散。
利用ＭｅＩＡＡ的这种特殊性质筛选突变体， 可以分离到ＭｅＩＡＡ代谢途径或者ＩＡＡ途径中新的成分。
我们对拟南芥种子进行ＥＭＳ诱变， 通过观察黑暗下下胚轴的生长情况， 筛选ＭｅＩＡＡ的抗性突变体。
我们成功分离到了８株可能的抗性突变体， 并对其中的一个Ｍｅｔｈｙｌ－ＩＡＡ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ １ （ｍｉｒ１） 突变体进行了深入分析。
ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选将为进一步了解ＭｅＩＡＡ的代谢、ＩＡＡ稳态调控和响应机理提供新的材料。
关键词 生长素， 图位克隆， ＭｅＩＡＡ， 抗性突变体侯仙慧， 丁茂予， 刘赛男， 李林川， 瞿礼嘉 （２００９）． 拟南芥 ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析． 植物学报 ４４， ５２−５８．生长素（ａｕｘｉｎ）是由荷兰科学家Ｆ． Ｗ． Ｗｅｎｔ通过燕麦胚芽鞘弯曲实验法 （Ａｖｅｎａ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ ｔｅｓｔ） 首次分离出来的（Ｗｅｎｔ， １９２６）。
拟南芥抗镧突变体的筛选及初步鉴定
拟南芥抗镧突变体的筛选及初步鉴定郭飞;卢杰;魏斌;张自立【摘要】利用乙酰甲基磺酸(EMS)诱变方法,以幼苗根在重力作用下的弯曲生长为指标,筛选得到了拟南芥抗镧突变体.通过进一步使用更高浓度镧对获得的突变体进行复筛,初步确定了KEMS-36植株为拟南芥抗镧突变体.【期刊名称】《安徽农学通报》【年(卷),期】2010(016)011【总页数】3页(P49-51)【关键词】拟南芥;抗镧;突变体【作者】郭飞;卢杰;魏斌;张自立【作者单位】安徽农业大学资源与环境学院,安徽合肥,230036;安徽农业大学资源与环境学院,安徽合肥,230036;安徽农业大学资源与环境学院,安徽合肥,230036;安徽农业大学资源与环境学院,安徽合肥,230036【正文语种】中文【中图分类】Q949.748.3拟南芥(Arabidopsis thaliana)属于高等植物中的十字花科植物。
拟南芥具有个体小、生长周期短、易于培养、种子数量多、基因结构简单且基因组序列已经全部测序，研究成果易于转化等特点，被称为植物界的“果蝇”，是一种典型的模式植物［1－2］。
作为模式植物，拟南芥更为重要的一个特点是非常容易通过诱导，产生大量的突变体，人工诱变产生突变体的方法有很多种，其中较为常用的有辐射诱变、插入诱变和化学诱变等。
稀土由化学元素周期表中镧系元素的15个元素和与其密切相关的另外2个元素——钪(Sc)和钇(Y)共17种元素组成，La元素是稀土中的一种。
稀土已经被广泛的应用于农业中，并且稀土元素的离子都具有较强的交换吸附能力，进入土壤后很难向地下渗透迁移，长期使用在土壤中必然会造成富集［3－4］，目前世界各国对稀土农用的环境生态效应都非常关注。
笔者所在的课题组通过对拟南芥突变体库连续不断的筛选和培养，初步获得了对La具有抗性的突变体，该突变体可以在较高浓度的La离子环境下生长，因此，该突变体对La离子富集所造成的环境伤害具有一定的修复作用，通过转基因手段可以将抗性基因移植到其他物种，对改造高稀土浓度的生态环境具有重要的意义［5］。
拟南芥突变体的筛选与鉴定综述
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述系别林学与园艺学院班级园艺102班姓名唐辉学号103231228答辩时间年月新疆农业大学林园学院拟南芥突变体的筛选综述唐辉指导老师：王燕凌摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。
在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。
在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。
概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。
总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。
关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究Screening Summary of Arabidopsis MutantsTang Hui Instructor:Wang YanlingAbstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screeningproposed resilience of Arabidopsis mutants.Key words: Arabidopsis；Mutant；Filter；Research拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。
EMS与NaN_3对甘蓝型油菜和芥菜型油菜诱变的效果
种 ( 湘油 15 号 、 中油 821 、 中双 9 号 ) 和 3个芥菜型油菜品种 ( 金油王 2 号 、 品系 153 和 154) 成熟种子进行诱变 。 以未处理组为 对照 , 比较了诱变当代 (M 1 ) 种子的发芽率和子代 (M 2 ) 株高、 叶色、 花色 、 种皮颜色和花粉育性等生物学性状 。 结果发现 , 随着 诱变剂浓度的增加和处理时间的延长各品种 ( 系 )M 1 代种子的发芽率逐渐降低 , 且相同处理条件下芥菜型油菜的平均发芽率 要低于甘蓝型油菜 ; 在 M 2 代中初步筛选出 28 个甘蓝型油菜和 38 个芥菜型油菜的株高 、 叶色 、 花色等性状的突变体 , 为今后油 菜遗传改良和功能基因组学研究提供了更丰富的研究材料 。 关键词 : 油菜 ; 突变体 ; 诱变; 甲基磺酸乙酯 ( EM S); 叠氮化钠 ( N aN3 ) 中图分类号 : S565. 4 文献标识码 : A 文章编号 : 1001- 8581( 2010) 09- 0006- 04
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收稿日期: 2010- 06- 13 基金项目: 长江大学博士启动基金项目。 作者简介: 赵福永 ( 1976 ), 男 , 湖南衡山人, 讲师 , 博士 , 主要从事植物基因工程研究。
9期
赵福永等 : EM S 与 N aN3 对甘蓝型油菜和芥菜型油菜诱变的效果
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纯级别。 1. 2 方法 EM S 处理: 处理方法参考 Andrea& A fza
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种子 (M 2 ) 。M 2 又于 2009年 10月分品种种植于试验田, 于不同生 育期 观测 株高、 叶 型、 花色 以及 花粉 育性等 性状。
进行。选取饱满、 无损伤的健壮种子装入网袋中, 每袋 200粒, 并作好标记。然后将装有种子的网袋放入盛有 蒸馏水的塑料小桶中于 20~ 22 ! 浸泡预处理 16 h, 随后 将种子袋取出并晾干备用。在通风柜中配制体积分数为 0. 05 %、 0. 1% 、 0 . 15% 的 EM S 处理液, 按每粒种子 1 m L 处理液配制各处理总液量。将已作预处理的种子分别处 理 4、 8、 12 h。处理完毕后, 种子用自来水冲洗 2 h , 晾干, 然后播种于实验田。以各品种未处理种子为对照。 NaN 3 处理: 处理方法参考李学宝等
突变体鉴定技术在植物育种中的应用
突变体鉴定技术在植物育种中的应用一、突变体鉴定技术概述突变体鉴定技术是指利用基因突变或染色体突变等突变现象，在生物体的基因组或染色体组中寻找变异体，并对其进行鉴定和评价的技术。
突变体鉴定技术在植物育种中的应用相对来说较为广泛，主要有随机突变体筛选、化学、物理诱变体筛选、转座子插入突变体筛选、RNAi抑制体筛选等。
二、随机突变体筛选技术随机突变体筛选技术是一种利用不同筛选策略来寻找植物新突变体的技术。
该技术主要包括自然突变体分离、EMS诱导突变体筛选、紫花苜蓿随机突变体筛选以及T-DNA插入突变体筛选等。
1. 自然突变体分离：自然突变体分离的原则是利用悬垂小球法获取悬浮球培养物，然后在培养物中筛选出不同的突变体。
自然突变体分离通常需要耗费一定的时间和人力成本，在实际应用中不太常用。
2. EMS诱导突变体筛选：EMS（乙基甲磺酸）是一种化学诱变剂，可以引起基因的点突变和染色体的断裂重组等现象。
EMS诱导突变体筛选的原理是将EMS作用于植物组织中，再根据所需特性筛选出目标突变体。
这种方法可以较为快速地诱导出培养物中的突变体，被广泛用于获得与生物体形态、生长等方面有关突变体的筛选。
3. 紫花苜蓿随机突变体筛选：紫花苜蓿随机突变体筛选主要是利用基于DNA甲基化的遗传活性指数技术，来评估苜蓿中的DNA甲基化水平差异所诱导的突变体。
该方法目前主要用于识别与生物体对环境胁迫或致病因素的响应相关的突变体。
4. T-DNA插入突变体筛选：T-DNA插入突变体筛选主要是通过构建T-DNA插入文库，将T-DNA插入到目标基因流区域，然后通过PCR扫描或其他遗传操作方法，鉴定得到的突变体，并进行筛选。
三、化学、物理诱变技术化学、物理诱变技术是指利用化学剂或物理因素对生物体进行诱变，产生一定比例的突变体，并对其进行筛选。
1. 化学诱变技术：化学诱变技术主要是利用一些化学剂，如硫酸亚铁等在处理过程中对目标植物进行诱变。
该方法操作简单，结果稳定可靠。
拟南芥H_2O_2突变体的筛选及特性分析
西北植物学报,2009,29(5):0867-0873Acta Bot.Boreal.2Occident.Sin. 文章编号:100024025(2009)0520888206拟南芥H2O2突变体的筛选及特性分析宋玉伟1,宋纯鹏2(1南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳473061;2河南大学生命科学学院,河南开封475001)摘 要:通过化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变模式植物拟南芥(A rabi dopsis thali ana)获得突变体筛选群体.在5mmol/L H2O2胁迫下,以叶片温度差异为筛选指标,利用远红外成像技术进行突变体的筛选,获得了对H2O2不敏感突变体hpi1(hy d rogen perox i de2insensitive1)和敏感突变体hps1(hy d rogen perox i de2sensitive1).进一步研究发现,两种突变均为单基因隐性突变,气孔密度同野生型一样,而叶片温度、气孔开度和叶片失水率则有明显的差异.种子萌发实验表明,hpi1对甘露醇(Man)和NaCl不敏感而对ABA敏感,h ps1则对3种胁迫都表现出敏感特性.关键词:拟南芥;远红外热像仪;H2O2;突变体筛选中图分类号:Q343.1+3文献标识码:AIsolation and Characteraction of H2O2Mutantsin Ar abidopsis t halia naSON G Yu2wei1,SON G Chun2peng2(1College of Life Science and Technology,Nanyang Normal University,Nanyang,He’nan473061,China;2Depart ment of Biolo2gy,Henan University,Kaifeng,He’nan475001,China)Abstract:Hydrogen peroxide(H2O2)signalling plays an important role in guard cells.Identification of new component s in H2O2signalling will p rovide a rational basis for biotechnological improvement s in t he devel2 op ment of drought2tolerant crop plant s wit h improved water2use efficiency.Through Screening an et hyl met hane sulfonate2mutagenized pop ulation for A rabi dopsis H2O2mutant s under5mmol/L H2O2by Infra2 red t hermograp hy,we isolated h pi1(hy d rogen perox i de2i nsensiti ve1)and h ps1(hy d rogen perox i de2sensi2 ti ve1)mutant s in A rabi dopsis.Identification and genetic analysis of t hese mutant s showed t hey were mon2 ogenic recessive mutations and t here exist distinct difference in sto mata apert ures,water loss and leaf tem2 perat ure compared to wild type,except for stomata density.In addition,seed germination test indicated t hat mutant s h pi1is insensitive to mannitol and NaCl,but sensitive to ABA.Mutant s h ps1is sensitive to all t hree st resses.K ey w ords:A rabi dopsis t hali ana;infrared t hermograp hy;H2O2;mutant screening 光、环境胁迫和植物激素等都可以引起植物体H2O2的升高,H2O2作为信号分子,不仅在诱导超敏反应、细胞凋亡中起关键作用,并且参与了植物叶片气孔运动的调节[1].大量证据表明植物体内产生H2O2可以通过调节保卫细胞内的信号转导蛋白,如蛋白质磷酸化酶、转录因子以及位于质膜或其他膜上的通道,从而启动下游信号转导,最终影响基因的表达,从而启动了气孔的开关[2,3].但是植物细胞①收稿日期:2008211205;修改稿收到日期:2009204214基金项目:973计划(2003CB114305);国家自然科学基金(39870372)作者简介:宋玉伟(1974-),男(汉族),博士,主要从事植物逆境生理及分子生物学研究.E2mail:nanyangyws@尤其是保卫细胞对H2O2如何感受和传递这种氧化信号、哪些中间成分介导了氧化信号的传递,何种顺式元件和相应的转录因子参与了该过程等问题仍然所知甚少,这一系列问题的解析需要通过功能基因组学和遗传学的研究.阐明这些分子机制,不仅有利于揭示其基本的生物学特征,而且对培育高效抗逆农作物也极为重要.植物通过叶片表面数亿万计的气孔蒸发水分,失水后可以改变表面的温度[4].利用灵敏的远红外成像系统可以检测这种微小的温度差异,这不仅克服了传统观察气孔行为的微观性和繁琐性,而且可以实现高通量、大规模的监控[5].本实验以气孔保卫细胞的开闭引起叶片表面温度微小变化为筛选指标,建立了有效的遗传学筛选体系.本实验通过外用H2O2对经化学诱变的拟南芥M2代幼苗进行胁迫,借助于远红外成像仪对胁迫的幼苗进行叶温监测,得到了对H2O2产生不同反应的突变体h pi1和h ps1.通过对两种突变体生理特性进行初步鉴定发现,它们对外源渗透胁迫的生理应答出现了差异,这说明这些基因的突变造成了植株应答胁迫的缺陷.该遗传材料的获得将会对研究植物应答氧化胁迫的分子机制提供新的视角,同时也为实现农业抗旱提供理论基础.1 材料和方法1.1 远红外热像仪远红外热像仪(ThermaCAM SC3000,美国)能够对红外线(8～9μm)产生反应.在室温下温度分辨率小于0.03℃.筛选突变体时,在垂直大约距幼苗叶片35～45cm高度安装好成像仪,并把颜色监视器同成像仪连接起来从而得到可视的植物热图.拍摄热图存于PMCIA存储卡中,随后通过计算机用该仪器系统所配热像图处理程序中的图像放大程序、面积分析程序、温度频度分布直方图程序进行拟南芥叶温分析和处理.1.2 植物材料诱变和培养以生态型拟南芥C24为材料进行诱变处理,诱变方法如下:称取1.5g(约70000粒)野生型种子,用双蒸水浸泡6～8h后,放于含有0.4%(V/V)甲基磺酸乙酯(EMS)的100mmol/L磷酸缓冲液(p H 7.5)的三角瓶中,封口后放在水浴(25℃)振荡器上振荡8h,然后用双蒸水漂洗种子10～15次,每次10min.将经EMS诱变处理后的拟南芥种子(M1)放于滤纸上干燥处理,然后均匀播种于混有蛭石的营养土中(蛭石∶营养土为3∶1,V/V),每株周缘间隔大约1cm左右.待4℃春化3d后放于温室(温度18～22℃、光照强度200μmol!m-2!s-1、光暗周期16h/8h、相对湿度65%)培养.大约8周后,用小孔直径为0.5mm的小筛子对成熟的种子(M2)进行采收并在干燥器中干燥2周后备用.1.3 过氧化氢处理及突变体的筛选撒播拟南芥M2代种子的花盆中放于培养间中培养.待幼苗生长12d左右(6～8片真叶)时,用5 mmol/L H2O2通过从花盆底部浇水的方法对其进行根部胁迫处理.通过远红外成像仪对处理后的M2代幼苗进行叶面温度检测,筛选出叶温有明显差异的植株作为潜在突变体,然后用弯头镊子把其从群体中移出进行单独培养,待单株收种子后进行遗传和生理分析.1.4 气孔开度、密度和叶片失水率测定小心撕取拟南芥野生型和突变体叶下表皮,用毛笔轻轻刷除上面粘附的叶肉细胞,制好表皮条放于倒置显微镜(10×40)下,测微尺测量气孔的开度大小.每次观察取3片表皮条,随机选取6个视野,每个视野40个气孔,测定记录120个气孔的开度,每个实验重复3～5次,统计其平均值和平行实验间的方差.气孔密度采用普通光学显微镜下统计1 mm2的气孔数,每一处理观察5个植株,取平均值.叶片失水率测定参照Leymarie等[6]的方法.实验重复4次.1.5 突变体在ABA、甘露醇(Man)和N aCl的萌发测定将突变体和野生型分别散播于MS以及MS分别附加2μmol/L ABA、200mmol/L甘露醇和180 mmol/L NaCl等的4种培养基中,4℃冰箱放置3d 后移入温室培养,6d后统计种子的萌发数,并进行拍照,最后在Excel中计算平均值,通过Origin软件作图.实验设4次重复.2 结果与分析2.1 筛选浓度确定为了利用远红外成像技术筛选H2O2突变体,我们通过长期摸索建立了一套有效的遗传学筛选体系.因为诱变致使产生多样性的突变基因从而造成大量突变表型,其中有一部分基因对气孔的调节是由于对H2O2胁迫有反应.这些基因的突变往往会造成叶片气孔调节失调致使叶片表面水分的蒸腾与野生型出现明显差异,而叶面水分的蒸腾强弱则使9885期 宋玉伟,等:拟南芥H2O2突变体的筛选及特性分析叶面温度出现差异,这些可以利用远红外成像仪精确检测出来,并且能把这种通过传统手段很难量化的指标以可视化图像呈现出来.当某一个基因的突变造成气孔对某胁迫刺激调节失调后,会表现出过分的“开"和“关".研究中把胁迫刺激下气孔过分的“开"称作不敏感,过分的“关"则称作敏感.在筛选之前,对该技术是否适宜于H2O2突变体的筛选进行可行性实验.通过设置一系列H2O2的浓度从根部进行处理,发现在5mmol/L H2O2处理下,野生型拟南芥幼苗叶片叶温处理的比没有处理(C K)升高了许多,出现了明显的叶温差异(图版Ⅰ,A～D),叶片的平均温差可达0.9℃(表1).这可能是由于受到了胁迫,叶片气孔关闭,蒸腾减少,而使叶温升高.因此,本实验以5mmol/L H2O2作为筛选的浓度.表1 两种不同处理的野生型叶温平均值Table1 The average leaf temperatures ofwild type under different treatments处理Treat ment叶面温度Temperat ure/℃dd H2O(CK)19.3±0.25mmol/L H2O220.1±0.3 注:数据为叶面50个点的平均值±标准差.下同.Note:The values are mean±SD of measurement s on50point s on leaves.The same as below.2.2 H2O2敏感和不敏感突变体的筛选利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变拟南芥野生型种子,分成30份分别撒播于土壤中,收获的M1代种子通过其自交而获得大约8万粒M2代种子.随后,把这些种子均匀散播于盛满营养土的花盆中,待10d左右,进行5mmol/L H2O2处理.处理后3～4 h,通过远红外成像仪进行突变体的筛选.当对诱变的M2代幼苗进行筛选时,叶温有低于周围幼苗的突变体,也有高于周围幼苗的突变体.其中对于H2O2反应的突变体中,叶温低的命名为h pi(hy2 d rogen perox i de2i nsensitive),叶温高的命名为h ps (hy d rogen perox i de2sensiti ve).经过5mmol/L H2O2处理后,通过大量筛选得到一些潜在的突变体,将其中2株命名为h pi1(图版Ⅰ,E、F)和h ps1 (图版Ⅰ,G、H),经过对叶片温度数据统计分析发现,h pi1叶面平均温度要比野生型低1.46℃,而h ps1叶面平均温度要比野生型高1.25℃(表2).将它们单株移栽培养和收获种子,以进行表型鉴定和生理特性分析.2.3 突变体的遗传特性分析为了进一步确定筛选时的温度差异表型,对表2 野生型、hpi1和hps1叶温平均值Table2 The average leaf temperature ofWT,hpi1and hps1野生型或突变体Wildtype or mutant叶面温度Temperature/℃WT114.8±0.5hpi113.4±0.3WT212.4±0.3hps113.6±0.2 注:h pi1和h ps1分别为野生型W T1和WT2的突变体.Note:WT1and WT2are wildtype compared wit h h pi1and h ps1 respectively.h pi1和h ps1单株收获的种子进行了相同的H2O2胁迫处理,发现它们胁迫前后温度差存在明显差异(图1,A),即野生型胁迫前后变化0.4℃,而h pi1和h ps1则分别为0.2℃和0.5℃,这些结果说明了突变体在应答H2O2胁迫时叶温出现了明显的失调.对它们在正常情况下的气孔密度和气孔开度进行测定,发现气孔密度没有明显差异(图1,A),而气孔开度上存在明显不同.在正常条件下hpi1的气孔开度平均值要比WT大1.1μm,而hps1则要比WT 小0.9μm.同时,在5mmol/L H2O2处理下WT的平均气孔开度减小1.2μm,而hpi1和hps1则分别减小0.3μm和0.4μm(图1,B).失水率实验进一步说明了这种差异.随着时间的延长,h pi1比W T失水明显增加,而h ps1则刚好相反(图1,C).这些结果说明了h pi1和h ps1叶温同野生型存在的差异可能主要来自于气孔的开度而不是气孔的密度.对所得到的h pi1和h ps1突变体与野生型进行遗传杂交分析,发现在F1代都表现出野生型表型,而在F2代则发生了性状分离,其中野生型和突变体比例为3∶1,从而确定为单基因隐性突变(表3).2.4 ABA、甘露醇和N aCl对突变体种子萌发的影响在正常的生长条件下,h pi1和h ps1种子的萌发率同野生型没有差别,而在2μmol/L的ABA、200mmol/L的甘露醇和180mmol/L的NaCl胁迫8d后,h pi1种子萌发率明显高于野生型,而h ps1则比野生型略低(图2).统计分析表明,在2μmol/L 的ABA、200mmol/L的甘露醇和180mmol/L的NaCl等胁迫处理下,h pi1的萌发率要比正常条件下分别降低71.5%、23.3%和19.6%,而h ps1则分别降低74.5%、72.7%和73.6%.结果显示,在180 mmol/L的NaCl固体培养基上,野生型和h ps1种子的萌发明显受到了抑制,而这种抑制在h pi1的种098西 北 植 物 学 报 29卷子则要明显放缓(图版Ⅰ,I ～N ).在2μmol/L 的ABA 处理下,h pi 1、h ps 1和野生型萌发率没有差别,说明了h pi 1和h ps 1可能存在于不依赖于ABA信号的转导途径中.表3 突变体杂交遗传分析Table 3 G enetic analysis of mutants杂交类型Cross F 1野生型Wildtype 突变体MutantF 2野生型Wildtype 突变体Mutant 总计(株)Total 卡平方x 2W T ×hpi 130007362509860.07W T ×hps 14664561476030.12图1 野生型和突变体表型分析A.野生型、h pi 1和hps 1在胁迫处理前后的叶面平均温度差和气孔密度;B.野生型、h pi 1和hps 1在正常条件下和5mmol/L H 2O 2处理下的气孔开度;C.野生型、h pi 1和hps 1正常条件下叶片失水率Fig.1 Phenotype analysis of W T and mutantsA.The difference of leaf temperatures and stomatal density between stress and non 2stress in W T and mutant s ;B.Stomatal opening of W T and mutant s in normal and 5mmol/L H 2O 2stress ;C.Water loss of detached leaf in WT and mutants图2 野生型、hpi 1和h ps 1在ABA 、甘露醇和NaCl 胁迫8d 的萌发率Fig.2 Seed germination rate for WT and mutantsunder ABA ,mannitol and NaCl stresses3 讨 论H 2O 2不仅参与了植物对逆境的防御作用[7],而且作为信号分子参与了许多生理反应的调节,如细胞程序性死亡[8]、ABA 诱导的气孔关闭、基因的表达[9]、生长素调节的重力反应[10]、机械伤害发应[11]、系统获得抗性[12]和植物的病害反应[13]等.此外,近些年来关于H 2O 2作为重要的信号分子参与气孔运动的调节也大量报道[3],但是对H 2O 2作为信号分子其信号转导途径的详细过程了解仍处于刚开始阶段,诸如感受子、受体等许多基本问题仍不清楚.使用转基因植物和H 2O 2信号转导的突变体来阐明这些问题是一种重要的途径.由于植物水分蒸腾主要通过气孔进行的,因此利用远红外成像技术筛选突变体在理论上应该是十分有效的.目前,利用该技术成功地完成了对大麦和拟南芥气孔突变体筛选[5,14]、植物气孔导度的研究1985期 宋玉伟,等:拟南芥H 2O 2突变体的筛选及特性分析和植物在胁迫环境中的叶片蒸腾时空分析[15].这些结果说明了该方法的可行性.当然,蒸腾降温所带来的变化不但依赖于气孔本身的变化,而且还要依赖于气孔密度以及叶片表面蜡质层结构透性,这些原因在一定程度上也会造成叶片失水加速从而出现叶温差异.但目前的研究结果都说明了这种叶温的差异都来自于气孔的调节失调.利用该技术本实验筛选得到了H2O2突变体h pi1和h ps1.通过对它们进行生理特性的初步鉴定发现二者同野生型存在差异,尤其是控制气孔的开闭调节和应答渗透胁迫反应都出现了失调.这些结果说明,h pi1和h ps1突变基因可能会通过过氧化氢依赖的途径参与气孔开关的控制和抗胁迫反应的应答.该遗传材料的获得为进一步确定植物细胞中,尤其是在保卫细胞中关于H2O2参与的新的控制气孔关闭的调控分子机制提供有价值的遗传材料,也将为提高作物产量提供分子改良的遗传学依据.参考文献:[1] WAN G P C,DU Y Y,AN G Y,et al.Analysis of global expression profiles of A rabi dopsis genes under abscisic acid and H2O2applications[J].J ournal of I ntegrati ve Plant B iolog y,2006,48(9):62-74.[2] WAN G P T,SON G C P.Guard2cell signalling for H2O2and abscisic acid[J].N ew Phytol.,2008,178(4):703-718.[3] STEV EN N,RAD HIKA D,J O HN H.Hydrogen peroxide signalling[J].Current Opinion in Plant B iology,2002,5(5):388-395.[4] RASKIN I,J UANITA A R.Isolation and characterization of a barley mutant wit h abscisic acid insensitive stomata[J].Planta,1988,173:73-78.[5] MERLO T S,MUSTILL I A C,GEN T Y B,et e of infrared t hermography to isolate A rabi dopsis mutant s defective in stomatal regu2lation[J].T he Plant J ournal,2002,30:601-609.[6] L EYMARIE J,VAVASSEU R A,LASCEV E G.CO2sensing in stomata of abi121and abi221mutant s of A rabi dopsis t haliana[J].PlantPhysiol.B iochem.,1998,36(7):539-543.[7] FIN KEL T,HOLBROO K N J.Oxidant s,oxidative stress and t he biology of ageing[J].N at ure,2000,408(6809):239-247.[8] DESIKAN R,RE YNOLDS A,HANCOCK J T.Harpin and hydrogen peroxide bot h initiate programmed cell deat h but have differentialeffect s on gene expression in A rabi dopsis suspension cultures[J].B iochem.J.,1998,330:115-120.[9] GUAN L M,ZHAO J,SCANDAL IOS J G.Cis2element s and trans2factors t hat regulate expression of t he maize Cat1antioxidant gene inresponse to ABA and osmotic st ress:H2O2is t he likely intermediary signaling molecule for t he response[J].Plant J.,2000,22(2):87-95.[10] J OO J H,BA E Y S,L EE J S.Role of auxin2induced reactive oxygen species in rootgravitropism[J].Plant Physiol.,2001,126(3):1055-1060.[11] OROZCO C,NARVA EZ V J,CLARENCE A R.Hydrogen peroxide act s as a second messenger for t he induction of defense genes in to2mato plant s in response to wounding,systemin,and met hyl jasmonate[J].Plant Cell,2001,13(1):179-191.[12] INZ∗D,MON TA GU V M.Oxidative stress in plant s[J].Curr.Opin.B iotech.,1995,6(10):153-158.[13] MIT TL ER R,H ERR E H,ORVAR B L,et al.Transgenic tobacco plant s wit h reduced capability to detoxify reactive oxygen intermedi2ates are hyperresponsive to pat hogen infection[J].Proc.N atl.A A,1999,96(24):14165-14170.[14] RASKIN I,J UANITA A R.Isolation and characterization of a barley mutant wit h abscisic acid insensitive stomata[J].Planta,1988,173:73-78.[15] J ON ES H G.U se of t hermography for quantitative studies of spatial and temporal variation of stomatal conductance over leaf surfaces[J].Plant,Cell&Envi ronment,1999,22(9):1043-1055.298西 北 植 物 学 报 29卷 图版Ⅰ 拟南芥H 2O 2突变体筛选浓度的确定、筛选及萌发实验A.5mmol/L H 2O 2处理拟南芥野生型;B.双蒸水处理野生型(CK );C.图A 的红外热图;D.图B 红外热图;E.筛选hpi 1的M 2代幼苗群体;F.图E 的红外热图;G.筛选h ps 1的M 2代幼苗群体;H.图G 的红外热图;I 、J 、K 分别为野生型、hpi 1和h ps 1在MS 上生长8d 的情况(CK );L 、M 、N 分别为野生型、h pi 1和h ps 1在180mmol/L 的NaCl 处理下生长8d 的情况.Plate Ⅰ Confirmation of H 2O 2concentration for screening H 2O 2mutant s and isolation and gemination assay of H 2O 2mutant sFig.A.Photograph of wildtype under 5mmol/L H 2O 2treat ment ;Fig.B.Photograph of wildtype under dd H 2O treat ment ;Fig.C.Infrared image of A ;Fig.D.Infrared image of B ;Fig.E.Photograph of a population of M 2plant s for h pi 1;Fig.F.Infrared image of E ;Fig.G.Photograph of a population of M 2plant s for h ps 1;Fig.H.Infrared image of G;Fig.I ,J ,K.Growt h status for 8d of WT ,h pi 1and hps 1on MS mediumt ;Fig.L ,M ,N.Growt h status for 8d of W T ,h pi 1and h ps 1after 180mmol/L NaCl treat ment.3985期 宋玉伟,等:拟南芥H 2O 2突变体的筛选及特性分析。
拟南芥——一把打开植物生命奥秘大门的钥匙
张振桢1,2，许煜泉2，黄海1*（1 中国科学院上海生命科学研究院上海植物生理生态研究所，上海200032；2 上海交通大学生命科学技术学院，上海200030）摘要：在过去的20 年中，拟南芥作为模式植物广泛用于植物生命科学研究。
历时10 年的模式植物拟南芥的全基因组测序工作于2000 年完成，通过测序获得的拟南芥基因组核苷酸序列全部公布在互联网上，有力地推动了植物生命科学研究向前发展。
科学家提出的“2010 计划”旨在通过全世界植物科学家的努力，到2010 年能够尽可能多地了解拟南芥基因的功能。
通过拟南芥研究所获得的信息将有助于人类对控制不同植物复杂生命活动机制的认识。
关键词：拟南芥；模式植物Arabidopsis, a powerful tool for exploring the mysteries of plant kingdomZHANG Zhen-Zhen1,2, XU Yu-Quan2, HUANG Hai1*(1 Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy ofSciences, Shanghai 200032, China; 2 College of Life Science and Biotechnology, Shanghai JiaotongUniversity, Shanghai 200030, China)Abstract: During the past 20 years, Arabidopsis thaliana was widely used as a model system in plant scientific researches. Nucleotide sequencing of the Arabidopsis genome was completed in 2000, and the entire sequencing data were released on the Internet. The use of this wealth of sequence information has accelerated progress toward a comprehensive understanding of the genetic mechanisms, by which plants develop and response to the environment. The goal of the Arabidopsis 2010 project proposed by plant scientists is to establish the function of as many Arabidopsis genes as possible by year 2010. The information from the Arabidopsis researches will be certainly useful in elucidating the complex life activities of different plant species.Key words: Arabidopsis thaliana; model plant拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科，与白菜、油菜、甘蓝等经济作物同属一科。
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1、当Fv/Fm比值在0.5左右时,说明在突变体中 PSll内部的电子传递受阻或者突变体中部分PSll功 能丧失的结果。这是由于Fo升高引起的。
2、当Fv/Fm比值高于0.6时，则认为PSll下游电子 传递链复合物(包括PSI和细胞色素b6/f等)受到影 响。
3、当突变体的Fv/Fm降低到0.7左右，说明在突变 体中Psll内部的电子传递没有受阻，而可能是PSll 以后的Cytb6f或PSI复合物发生突变的结果。
因为很多与光合作用相关的基因突变,会直接引 起叶片颜色的改变。叶色变异是比较常见的突 变性状,一般在苗期表达,但少数突变体直到发 育后期才发生叶色突变。由于基因突变往往是 直接或间接影响叶绿素的合成和降解,改变叶绿 素含量和叶绿素a/b的比值,所以叶色突变体也 多为叶绿素突变体。叶色突变体的分类主要从 苗期叶色来划分,如白化、黄
• 适当的选择压力应当是既能使突变体的优 势得到发挥,又能使野生型受到足够的压力 而不能表现。在筛选突变体之前,首先要设 计一系列的筛选浓度,以野生型完全不能生 长的浓度确定为筛选浓度。
根据高叶绿素荧光表型筛选突变体
• 其中高叶绿素荧光表型,作为光合电子传递链受损的标 志,广泛地应用于筛选光合组分功能缺失的突变体。在 正常的条件下,光化学反应与非光化学途径活性很高,荧 光的释放很低(约3一5%);相反,如果由于类囊体膜蛋白 复合体结构的改变等原因而造成的光合电子传递的受 阻,则所吸收的光能不能有效传递转变成化学能,便会以 热或高荧光的形式释放出来,使光受体从激发态回到它 的稳定态(基态),导致吸收的能量以红色荧光进行释放 的比例增加,这样我们便能在暗室中观察到与正常植株 所发出的暗红色荧光相比是亮红色的荧光,即产生高荧 光(hcf)的表型从而将突变体筛选出来。
• 叶绿素荧光成像系统对突变体进行筛选， 设定不同伪彩色参数挑选出Fo；Fm； Fv/Fm;NPQ变化的突变体。
室温状态下,暗适应后的突变体野生型各生 长时期植株用于分析。
• 过程： • 1、测量前，使植株暗适应至少30分钟； • 2、打开测量光(measuring light,650nm的脉冲测量红
下春化3天后种植。
诱变植株培养：
• 将经EMS诱变处理后的拟南芥种子(M1)播 种于用1 /4Hoagland营养液浸透的混有蛭石 的营养土中(营养土:蛭石=2:1, v/v),种植后 覆盖塑料薄膜以保持湿度。在温度18~22℃、 光照强度120μmol/m2s-1、光暗周期16h/8h 条件下培养,待种子成熟后分行采收种子 (M2代)。
• 植物叶片经过充分暗适应后,PSI和PSll均处于
还原状态，在650nm,光强为0.05o.1μmol/m2s的测量红光下，由于Psl主要吸收 远红光，Psll主要吸收红光，此时叶片电子传 递过程主要停留在PSll中，得到稳定的初始荧 光值FO。施加单饱和脉冲(3000μmol/m2 s for 0.8s)后，Psll暂时达到饱和，Psll的电子受体 QA被完全还原，叶绿素荧光产量由基态F(o) 上升到最大值F(m)。这可以决定PSll最大光化 学量子产量,Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Maximum quantum yield of PSll)，表明最大PSll光能转 化效率。在拟南芥野生型叶片中,常在0.8-0.84 之间。
以稳定，得到Ft，在激活光存在下打开单饱和光(a saturating flash of light,持续800ms,光强为 6000μmol/m2 s)脉冲一次，与此同时，测量光脉冲频 率变为20KHz，得最大荧光值Fm。 • 6、等曲线回落下来并达到稳定，关闭激活光，再关闭 测量光。记录Fo,比率(Fm一Fo）/Fm=Fv/Fm,光饱和曲 线等。
100mmol/L磷酸缓冲液配置：
• 1、准备100ml 1M K2HPO4和100ml 1M KH2PO4;
• 2、将70ml K2HPO4和20ml KH2PO4在烧 杯中混匀；
• 3、用KH2PO4将PH调到6.5； • 4、将1M的磷酸缓冲液稀释到100mmol/L。
突变体筛选
• 根据光合色素的改变来筛选叶色突变体
EMS诱变拟南芥
诱变方法： 称取250mg(约5000粒)野生型种子+25ml重蒸水 →50ml烧杯内搅拌30min→4℃下放置12h→30ml 100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)的100ml三角瓶中 →加入0.2%(v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)→封口后 放在水浴(25℃)振荡器上振荡12h→50ml蒸馏水 漂洗种子4次,每次15min→将漂洗好的种子置4℃
知识回顾 Knowledge Review
光，脉冲频率为1.6KHz,光强0.05μmol/m2 s)，得最小
荧光值Fo； • 3、得到稳定的初始荧光值Fo，施加0.8s的单饱和脉冲
光(3000μmol/m2 s); • 4、1.5分钟后，曲线基本稳定，打开激活白光(actinic
light，光强为40μmol/m2 s); • 5、7.5分钟时光合作用己达到稳定状态，曲线基本可
根据叶绿素荧光参数筛选突变体
• 以叶绿素荧光参数为指标,可以得到不同类型的 突变体,其中影响非光化学淬灭（NPQ)和Psll的 有效量子产率(Φll)是两种主要类型的突变体。
突变体筛选： 接种:拟南芥种子用10%次氯酸钠浸泡15分钟,其
间不时的振荡使灭菌充分,再用无菌水冲洗种子 3次以上,灭菌处理后的种子点播于含3%的蔗糖 的MS固体培养基(0.8%琼脂)上,接好的种子放 在4℃冰箱里春化2天。 培养:于22℃下,光强120μmol/m2sec(12h光照/12h 黑暗)的光照条件下培养15-20天之后进行筛选。