线虫的EMS诱变和突变体筛选2015
EMS诱变
EMS?诱变？常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。
小心点，那东西剧毒且致癌。
人工化学诱变技术:化学诱变技术是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做“化学诱变剂”。
其特点有：可操作性强，简单易行；特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基；后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定；应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。
诱变剂主要包括5类，他们的特点、机理和应用如下：1、烷化剂：能使一些碱基烷基化，比如使鸟苷酸甲基化，影响mRNA的转录，从而使蛋白质的表达紊乱，使得蛋白质重组，而改变了性状。
临床上应用此类物质作为抗癌药物，具有强烈杀伤癌细胞的作用，所以在应用在于植物上时，也要注意他的强烈杀伤性。
主要有：甲基磺酸乙酯（EMS），是最常用的诱变剂，我们曾用作真菌的遗传标记，诱变率很高。
常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。
该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。
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硫酸二乙酯（DMS），也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用，作用机理和使用方法和EMS基本相同。
属于剧毒品，受公安局管治。
乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。
只要用于大量诱变育种用，使用浓度：0.0001-0.1%，高度致癌性！使用时需要使用缓冲液配置。
盐酸氮芥，用于抗癌药物，可以从药店买到，但有些地方必须有主任医师的处方。
一般是针剂，稍加稀释即可使用，作用时间5-10min，可用甘氨酸作为终止剂和解毒剂。
环磷酰胺、亚硝基胍等物质也可作为诱变剂使用，但较少使用。
2、碱基类似物：分子结构类似碱基，导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。
该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。
主要有：6-溴尿嘧啶、6-BudR、马来酰肼、2-氨基嘌呤等，同样属于抗癌药物，可到药店买到，稍加稀释即可使用。
EMS玉米花粉诱变及根系突变体筛选的开题报告
EMS玉米花粉诱变及根系突变体筛选的开题报告题目：EMS玉米花粉诱变及根系突变体筛选一、研究背景EMS是一种强效的诱变剂，可在一定程度上增加植物的遗传变异性，创造许多对植物育种有用的突变体。
玉米是世界上最重要的粮食作物之一，通过EMS诱变可以改变玉米植株的形态、生长和抗逆性等性状，进而提高玉米产量和品质。
二、研究内容和目的本研究旨在应用EMS诱变玉米花粉和根系，筛选出具有重要农艺性状变异的突变体，以期为玉米育种提供新的遗传资源。
具体研究内容包括：1.采集玉米花粉，利用EMS进行诱变处理，筛选出具有明显花部形态和花期改变的突变体；2.利用EMS处理玉米种子，种植后进行根系形态和生长性状等方面的观察和分析，筛选出具有明显根系形态和生长性状改变的突变体；3.对筛选出的突变体进行生理生化和分子生物学等方面的研究，探讨其遗传变异的机制。
三、研究方法1.玉米花粉诱变：选取健康的玉米穗，待玉米丝变黄后切割下方的花穗，将花穗置于含有不同浓度EMS 的溶液中进行诱变处理，分别选取无明显病害和形态异常的玉米胚珠进行培育，筛选出具有明显花部形态和花期改变的突变体。
2.玉米根系诱变：将玉米种子浸泡在含有不同浓度EMS的溶液中，待种子吸收充分后种植于培养皿中，在不同生长阶段对根系形态和生长性状等方面进行观察和分析，筛选出具有明显根系形态和生长性状改变的突变体。
3.生理生化和分子生物学研究：对筛选出的突变体进行生理生化和分子生物学方面的研究，探讨其遗传变异的机制。
四、预期结果和意义本研究通过EMS诱变玉米花粉和根系，筛选出具有重要农艺性状变异的突变体，为玉米育种提供新的遗传资源，并为揭示植物诱变机制提供参考。
此外，还可以通过对突变体的分子标记和遗传定位等研究，挖掘出与对玉米生长和产量影响较大的基因，并为后续玉米基因功能研究提供重要的启示和资料。
线虫的EMS诱变和突变体筛选2015
线虫的EMS诱变和突变体筛选摘要：秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. eleganS是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。
本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80C保存。
本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。
将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。
关键词：秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体1.引言秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。
它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天(25C)。
野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。
温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80 C冰箱长期保存线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。
它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。
基因敲除
线虫基因敲除的方法由俄克拉荷马医药研究中心的Bob Barstead 和Gary Moulder 等人创立，并由此衍生和发展。
该方法的理论基础在于：诱导大量线虫发生突变，提取这些突变线虫的DNA，利用巢式PCR 检测突变的位点，最终通过测序确认突变序列，从而建立线虫某一基因突变的种系。
具体步骤如下：
1.诱导大量线虫突变：将怀孕成虫用碱性漂白剂裂解得到卵，在20℃生长52小时，到L4幼虫期时用EMS,DEB,TMP等诱变剂诱导线虫突变，生长24小时得到PO代怀孕成虫，再用漂白剂裂解得到F1代卵，生长24小时得到F1代L1期幼虫，收集线虫，每个琼脂糖平板涂布500只F1代L1期幼虫，共1152个平板，生长5天，收集F2代。
如图2所示
2.提突变线虫DNA：将F2代线虫放入1152个60mm NGM 琼脂糖平板培养，收集25％加入到微滴微阵列中，再加入蛋白酶K，65℃孵育，剩下75％保存在15℃恒温箱中。
收集DNA 样本，准备做PCR。
3.巢式PCR检测：查出需要敲除的目的基因序列片段，设计2对引物AD,BC，第2对引物要在第1对之间。
PCR反应成分：96孔板中加入上步提取的DNA（模板），Buffer，dNTPs,Taq，引物A,D，跑35个循环。
将反应产物作为模板转移到另一块96孔板上，按上述PCR体系再做一次PCR，其中引物换成B,C，跑35个循环。
将PCR产物跑胶，分析。
大意如下图所示，对比MARKER找到与目的片段大小不同的条带，切胶回收，测序，与目的基因比较确认是否是突变序列，确认后找到相应线虫保存，建立基因突变体系。
拟南芥ems诱变与突变体筛选
1、当Fv/Fm比值在0.5左右时,说明在突变体中 PSll内部的电子传递受阻或者突变体中部分PSll功 能丧失的结果。这是由于Fo升高引起的。
2、当Fv/Fm比值高于0.6时，则认为PSll下游电子 传递链复合物(包括PSI和细胞色素b6/f等)受到影 响。
3、当突变体的Fv/Fm降低到0.7左右，说明在突变 体中Psll内部的电子传递没有受阻，而可能是PSll 以后的Cytb6f或PSI复合物发生突变的结果。
因为很多与光合作用相关的基因突变,会直接引 起叶片颜色的改变。叶色变异是比较常见的突 变性状,一般在苗期表达,但少数突变体直到发 育后期才发生叶色突变。由于基因突变往往是 直接或间接影响叶绿素的合成和降解,改变叶绿 素含量和叶绿素a/b的比值,所以叶色突变体也 多为叶绿素突变体。叶色突变体的分类主要从 苗期叶色来划分,如白化、黄
• 适当的选择压力应当是既能使突变体的优 势得到发挥,又能使野生型受到足够的压力 而不能表现。在筛选突变体之前,首先要设 计一系列的筛选浓度,以野生型完全不能生 长的浓度确定为筛选浓度。
根据高叶绿素荧光表型筛选突变体
• 其中高叶绿素荧光表型,作为光合电子传递链受损的标 志,广泛地应用于筛选光合组分功能缺失的突变体。在 正常的条件下,光化学反应与非光化学途径活性很高,荧 光的释放很低(约3一5%);相反,如果由于类囊体膜蛋白 复合体结构的改变等原因而造成的光合电子传递的受 阻,则所吸收的光能不能有效传递转变成化学能,便会以 热或高荧光的形式释放出来,使光受体从激发态回到它 的稳定态(基态),导致吸收的能量以红色荧光进行释放 的比例增加,这样我们便能在暗室中观察到与正常植株 所发出的暗红色荧光相比是亮红色的荧光,即产生高荧 光(hcf)的表型从而将突变体筛选出来。
EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725
EMS突变体致变基因鉴定在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。
采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。
在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。
常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。
随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。
根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略：方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。
方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。
该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。
变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。
方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量又可降低测序成本。
由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。
水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。
该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。
EMS诱变番茄自交系TTD302A的突变表型鉴定和分析_杨建华
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《中国蔬菜》学术论文下载
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研究论文
中国蔬菜
CHINA VEGETABLES
出现叶片表型变异，变异频率为 1.5%（突变单株 / 总单株数） 。对照的叶片表现为绿色，二回羽状复 叶，叶片平展，裂刻中等（图 3-a） 。M2 群体叶片 变异主要发生在叶片颜色和叶片形态上，颜色变 异有黄色叶（图 3-b） 、黄绿色叶、颜色嵌合叶、 浅绿色叶（图 3-e） 、深绿色叶（图 3-f） 。黄绿色 叶变异有两种表现形式，即新生叶黄绿，老叶绿色 （图 3-c-1）和老叶黄绿，新生叶绿色（图 3-c2） 。颜色嵌合叶变异表现两种类型， 即白绿嵌合 （图 3-d-1）和白黄绿嵌合（图 3-d-2） 。在黄色叶、黄 绿色叶和颜色嵌合叶中，除了白绿色嵌合突变株在 整个生育期一直稳定表现外，其余的只出现在苗 期，变异色会随着生育期的推进逐渐恢复为正常叶
1 材料与方法
1.1 试验材料 番茄自交系 TTD302A，由西北农林科技大学园 艺学院番茄课题组提供。该品系为普通番茄，有限 生长型，果实粉色，大小均匀，单果质量为 250 g， 配合力高，综合性状良好。 1.2 试验方法 1.2.1 种子诱变处理 2012 年 3 月，挑选 2 200 粒 — 21 —
表 2 EMS 诱变 TTD302A M2 群体突变表型分类
器官 变异类型 类型 叶器官 叶片颜色 变异表型 变异数 1 15 4 11 5 3 14 1 2 5 3 2 66 2 15 9 22 11 3 6 7 10 3 3 1 5 2 3 12 1 3 3 2 3 126 3 3 7 2 13 3 13 13 3 9 12 81 5 6 2 2 12 1 3 1 68 100 373
苦荞EMS诱变群体的创建及农艺性状分析
苦荞EMS诱变群体的创建及农艺性状分析邓琳琼;张以忠【摘要】利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变处理苦荞(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn)种子,对M2代突变材料进行生物学性状与农艺性状鉴定和分析,M3代材料进一步验证.结果表明,试验获得了叶片肥大、早熟、晚熟、小粒、矮秆和黄化6种稳定遗传的突变体.叶片肥大、早熟和晚熟突变体的株高、主茎分枝数、主茎节数、株粒数、株粒重和千粒重与对照间均无显著差异.矮秆突变体的株高和主茎分支数以及小粒突变体的株粒重和千粒重显著低于对照,其他性状与对照间差异不显著.黄化突变体的株高与对照无显著差异,主茎分枝数、主茎节数、株粒数、株粒重和千粒重均显著低于对照.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(000)014【总页数】5页(P3343-3347)【关键词】苦荞(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn);甲基磺酸乙酯;突变体;农艺性状【作者】邓琳琼;张以忠【作者单位】贵州工程应用技术学院生态工程学院,贵州毕节551700;贵州工程应用技术学院生态工程学院,贵州毕节551700【正文语种】中文【中图分类】S517突变体是某个性状发生可遗传变异或某个基因发生突变的材料,是遗传育种的重要资源,也是开展功能基因研究的重要材料,而且当今功能基因组学所取得的一些成果,也是建立在大量不同类型突变体的基础之上［1－3］。
由于自发突变产生突变体的频率非常低,传统育种技术周期长,不能满足当前荞麦生产对优良品种的需求。
化学诱变可以大大提高突变频率,加快新种质资源的创制速率。
甲基磺酸乙酯（EMS）是目前使用最广泛、效果最好的化学诱变剂,由于其诱变方法简便、诱变频率高、诱变范围广、染色体畸变相对较少、可以对作物的某一种特殊性状及其品质进行改良,因多为显性突变体,易于进行筛选,因此在其他作物上已被广泛利用［4－6］。
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线虫的EMS诱变和突变体筛选摘要：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。
本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80℃保存。
本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。
将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。
关键词：秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体1.引言秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。
它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天（25℃）。
野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。
温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80℃冰箱长期保存线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。
它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。
但也有其缺点，如：①线虫的神经元细胞对RNAi不敏感；②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，所以一些人类疾病无法在线虫中模拟；③鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍是在药物研发初期，快速粗筛，提供线索，需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。
基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。
研究发现，线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量人类遗传疾病同源基因，只有大约58%是线虫特有的，所以，从理论上讲, 只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的, 就可能利用模式生物来进行研究。
目前，已经有许多成功的线虫病理模型，如：溶酶体病，阿尔茨海默症(Alzheimer’s, AD)，多囊肾病(polycystic kidney disease)，Duchenne 肌营养不良症，过氧化物体生物合成缺陷等。
甲基磺酸乙酯，简称EMS，是一种重要的致癌物之一，生物学上可以用来创建突变体库。
本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。
线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。
这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。
此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系，如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。
我们通过对排卵时期的线虫进行诱变，观察诱变后线虫突变体表形，对突变体后代进行筛选，探究影响突变型基因的显隐性，最终获得能够稳定遗传的突变体。
2.材料和方法2.1材料、试剂和器材实验材料：N2型秀丽隐杆线虫。
实验试剂：NGM（Nematode Growth Media）固体培养基、LB液体培养基、M9线虫生理溶液。
实验器材：培养皿、报纸、锥形瓶（500ml、300ml、100ml）、15ml离心管、蓝枪尖、黄枪尖、Ep管、5ml的塑料试管、高压蒸汽灭菌锅、离心机、酒精灯、移液枪（1000ml、200ml）。
2.2方法2.2.1仪器的洗涤、包装与灭菌，相关溶液的配制。
（1）仪器的洗涤与包装①用自来水洗涤55mm培养皿（我们组一次性洗12个培养皿），晾干后用报纸包装好，以待灭菌。
②洗涤500ml锥形瓶，300ml锥形瓶，100ml锥形瓶，15ml离心管若干，锥形瓶装入液体后，用锡纸封口，15ml离心管用报纸包好，以待灭菌。
③将蓝枪尖和黄枪尖塞入枪尖盒，用报纸包装好以待灭菌。
④将Ep管和5ml的塑料试管管放入玻璃瓶中，用报纸封口，以待灭菌。
（2）相关溶液的配制①NGM（Nematode Growth Media）固体培养基的配置按表1配置NGM固体培养基表1NGM固体培养基的配方②LB液体培养基的配置按表2配置LB液体培养基表2LB液体培养基的配方③M9按表3配M9线虫生理溶液表3 M9线虫生理溶液的配方(3)①打开高压蒸汽灭菌锅，设置灭菌温度120℃和灭菌时间10分钟，待压力上升到0.05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀，高压锅继续升温，自动灭菌。
②在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。
当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。
2.2.2倾倒NGM平板，摇菌与铺板（1）倾倒NGM平板①紫外灭菌无菌操作台5分钟。
②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。
③待固体培养基冷却至60℃，在酒精灯附近逐一倾倒平板，保证每个平板有NGM固体培养基约10ml。
④在培养皿皿盖上做好标记（包括组名，日期），待NGM固体培养基冷却后，如果不用菌液铺板，就用封口膜封口后倒置于4℃冰箱保存，如果菌液已经活化，则可直接铺板。
（2）菌种的活化与铺板①紫外灭菌无菌操作台5分钟。
②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。
③取出两管高压后的15ml离心管，用移液枪吸取液体配养基3ml,加入原始的OP50菌液300μl，过夜摇菌。
④取200~300μl活化的菌液均匀地铺在NGM固体培养基里，用手摇动晃匀菌液，封口膜封口后，平置于操作台上待菌液被吸收。
⑤等菌液被NGM固体培养基吸收后（一般20分钟），在37℃培养箱倒置培养，等细菌长出薄薄的一层（一般12-24hr）即可接线虫或倒置放在4℃冰箱保存。
⑥摇菌剩余的菌种可以与甘油1比1混合，颠倒摇匀，至于-20℃保存。
2.2.3.怀卵成虫的同步化（1）选择一个含有大量怀卵成虫的培养皿，用3mlM9洗下，放入5ml的塑料试管，加入0.8ml20%次氯酸钠，0.4ml0.5M的NaOH（事先配置次氯酸钠和NaOH各1ml）。
10min后，虫体破裂，溶液变澄清。
（2）3000转离心1min，弃上清。
（3）4mlM9，混匀，3000rpm，离心1min，弃上清。
（4）重复步骤（3）2~3次以去除残留的裂解液。
（5）加入0.2ml M9，混匀。
（6）将液体接种于NGM上，20℃培养，约56hr达到L4或20℃培养24hr,转至25℃培养大约21-22hr达到L4。
2.2.4.EMS诱变和突变体筛选（1）无菌条件下，将培养皿中处于L4早期的雌雄同体线虫用5ml M9悬浮，用移液器转移至无菌离心管中。
（2）1000rpm离心30s，去除上清，加入2mL M9。
（3）另取一只离心管，加入M9 2ml 以及20μl EMS ，拧紧盖子，振荡混匀。
（4）2mL 含线虫M9倒入2mL 含EMS M9 中，混匀，用封口膜密封。
（5）室温放置4~5 h ，混匀30min 。
（6）1000rpm 离心30s ，去除上清，加入3-4mL M9清洗。
（7）重复（6）3~4次。
（8）自然沉淀，去上清，留下1mL 连同虫子转入NGM 板上,每一个NGM 板上加200ul ，20℃培养2天后至产卵，移去成虫；（9）继续20℃培养若干天后连续观察，筛选能够稳定遗传的突变体及突变体的子代。
3.结果在4×（或10×）显微镜下观察到的线虫突变体和对照组如图所示。
3.1运动轨迹变化突变体图一 运动轨迹变化突变体的筛选 图一所示的是运动轨迹变化的突变体。
图1是野生型线虫的运动轨迹，设为对照组，图2至图5是突变后线虫的运动轨迹，设为实验组。
图2的运动轨迹较野生型相比更为平缓，图3的运动轨迹较野生型相比更为陡峭，而图4突变体的运动轨迹呈麻花状，图5突变体的运动轨迹极不规则并且十分纠结。
这些都是可能是线虫的突变体，但我们发现运动轨迹奇怪的突变体的子代轨迹又往往正常化了，我们做了如下推测：①运动轨迹的突变体是不可遗传的，表现为运动轨迹突变体可能是由环境决定的，或者是线虫发生体细胞突变引起的；②运动轨迹的突变体发生的突变可能是隐形突变，因此在后代所占比例太少，而且运动轨迹在虫子太多的时候又难以观察，所以难以获得稳定的运动轨迹奇怪的稳定遗传的突变体；③运动轨迹奇怪的线虫本身并没有发生突变，可能是由于自身兴奋而产生了奇怪的运动轨迹。
3.2形态特征变化突变体123141511 2 3 4 5 6图二形态特征变化突变体的筛选图二是形态特征变化的突变体。
图1是野生型成体期线虫的形态特征，设为对照组，图2至图6是突变后线虫的形态特征，设为实验组。
图2是严重卷曲，极少移动的成体期线虫突变体，图3是背部长小泡的成体期线虫突变体，图4是身体细长，并且头尾很尖的L4期线虫突变体，图5是短粗的成体期线虫突变体，图6是只能向左转弯的成体期运动障碍突变体。
其中，在这几种突变体中，身体细长，并且头尾很尖的突变体和向左转弯的运动障碍突变体是可遗传的显性突变体，其他几种突变体的后代都是野生型形态的线虫，不是稳定的突变体。
4.讨论（1）使用高压蒸汽灭菌锅时，一开始当压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后（也可以在5分钟之后），再关闭放气阀，以完全排除锅内空气，使灭菌才能彻底。
（2）灭菌完后，如果时间紧急，可在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。
当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。
（3）所配置的液体培养基高压后要分装在几个小量程的锥形瓶中，这样如果操作过程中液体培养基被污染，可防止配置的液体培养基全被污染。
（4）摇菌的时候一种菌摇两管，这样可以保证如果一管菌的菌种引入了杂菌，另一管菌液如果没被污染就还能用。
（5）无菌操作台在使用前应该先紫外灭菌5分钟，操作之前双手也应该用酒精消毒，以防止操作过程中造成实验污染。
（6）细菌要倒置培养，防止水蒸气滴到固体培养基上，影响微生物的生长、线虫的运动和杂菌污染。
（7）在用菌液铺板时，如果培养的是野生型线虫，为了让线虫均匀地在培养基上大量生长，需要均匀地铺板，如果是观察诱变体，则将菌液集中滴在中间，使线虫集中生长，利于观察突变体。