Western blot
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上 到下运动（负极到正极）， 分开
四 转膜
准备物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转
膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。 切滤纸 和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X 转模缓冲液浸湿。 • 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至 20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵 ①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。 ②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后 震荡。
灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余 空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板 流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气 泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
冰箱过夜 待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草 纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放 于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
详细介绍western blot
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
WesternBlot试剂的准备1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-Hcl PH 8.8）Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-Hcl PH 6. 8）Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）： Tris 15.2g甘氨酸94gddH2O 定容到1000mlSDS 5g先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
Western-blot法
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免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。
免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。
它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
图1 免疫印迹法原理示意图第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。
westen blot原理
westen blot原理Western blot（又称为蛋白质印迹）是一种重要的蛋白质检测方法，它可以用于检测蛋白质的相对分子质量、数量和抗原特异性。
Western blot是通过将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其迁移至膜上，然后使用特异性抗体对目标蛋白进行检测的技术。
Western blot 能够检测样品中可能存在于微量的蛋白质，并且能够区分具有不同结构或特征的不同蛋白质。
Western blot 的原理是：将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其转移到聚丙烯酰胺或聚乙烯膜上，然后使用荧光素或辐射的能量使膜上的蛋白质变得容易检测。
Western blot 检测使用的抗体通常是标记有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素的二抗或其他特异性抗体。
其中辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶可以清晰地显示特异信号，并且可以通过开发和显色识别来显示相对定量。
Western blot 主要用于检测特定蛋白质，如抗体和结构蛋白，但是与其他定量蛋白质方法相比，Western blot 需要相应的蛋白质特异性抗体。
尽管Western blot已成为一种常见的蛋白质分析方法，但是它的应用也因其灵敏性、帮助诊断某些疾病和进行药学研究而备受欢迎。
Western blot 的优点包括：1. 可检测特定蛋白质，能够区分不同的蛋白质。
2. 可在单个实验中同时检测多个蛋白质。
3. 可定量检测蛋白质。
4. 可在不同样品中比较蛋白质表达水平。
Western blot 检测的主要步骤包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳、转膜和检测。
下面我们就将分别介绍这些步骤。
1. 制备蛋白质样品Western blot 检测的首要步骤是样品的制备。
样品的制备是决定Western blot检测结果是否准确的关键。
在制备样品时，鼓励使用相同的样品制备方法和提取技术，包括细胞溶解、组织破碎和蛋白质提取等技术。
样品的制备要求能够尽可能避免蛋白质的失活和降解。
western blot
State Key Lab of Medical Neurobiology
定义：
※印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，利用相应的探测反应 来检测样品的一种方法
※1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用 DNA-RNA杂交检测特定DNA片段的方法，称为Southern印迹法
★夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在， 否则会导致转膜不完全
封闭
★目的：封闭膜上潜在的非特异性结合位点。避免一抗与 膜发生非特异性结合，从而导致非特异性背景的提高 ★封闭液： 5% 脱脂奶粉或3%BSA (含0.1% Tween20的TBS配制)
★封闭时间：摇床上室温封闭1-2h或4°过夜；
※ 玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁
蛋白酶抑制剂防止蛋白降解
※苯甲基磺酰氟（Pheylmethylsulfornyl fluoride，PMSF）: 不可逆的抑制剂，使用浓度为1mM。抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白 酶，但在水溶液中迅速失活 ※AEBSF: 丝氨酸蛋白酶抑制剂，使用浓度为4mM. AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低 ※ EDTA,EGTA： 使用浓度为1mM。通过螯合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属 蛋白酶 ※多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为2-20ug/ml 亮抑酶肽（Leupeptin）：抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶 胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）：抑制天冬氨酸蛋白酶 抑酶肽(aprotinin):抑制许多丝氨酸蛋白酶 苯丁抑制剂（Bestatin）：抑制氨基多肽酶
（Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构 的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度，是良好 的电泳介质。
western blot hrp酶不同酶促底物的原理
western blot hrp酶不同酶促底物的原理
Western blot是一种重要的免疫印迹实验技术，其中使用酶促底物对目标蛋白的信号进行放大和检测。
HRP（辣根过氧化物酶）是Western blot中常用的酶促底物之一。
不同酶促底物的原理如下：
HRP酶促底物原理：
1. 过氧化物酶（HRP）反应：HRP底物通常是一种无色化合物，例如TMB（三甲基苯胺基甲酸甲酯）或DAB（二氨基联苯胺）。
2. 底物氧化反应：在HRP存在下，TMB或DAB与过氧化氢（H2O2）反应产生氧自由基。
3. 显色反应：氧自由基进一步与TMB或DAB发生反应，产生有色化合物。
这个有色产物有机会与目标蛋白产生特定的水解反应，从而形成彩色的条带。
总结起来，Western blot中使用HRP酶促底物的原理是：HRP 底物与过氧化氢反应生成氧自由基，然后与TMB或DAB发生进一步反应，形成彩色的有色产物，从而检测目标蛋白的信号。
2-Western blot技术
目录
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电泳
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转膜
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封闭
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抗体孵育
室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
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ECL显影
暗室操作！
A液 B液 ECL工作液
混合
1
:
1
膜
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定性结果分析
E-cadherin
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注意的问题
为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使 用。室温较低时，TEMED或AP的量可加倍。 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，应注意防护。
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SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色
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3. 转膜
• 定义：要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例 如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 • 电泳转移方法：湿转和半干转。
• 转移膜的选择：硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜
聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF） 尼龙膜、DEAE纤维素膜
蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷
基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于蛋白质的分子量大小？
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2. SDS-PAGE
SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强
还原剂的溶液中可与蛋白质形成 SDS-蛋白质复合物。
1.4g SDS/1g 蛋白质
SDS 带负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除 各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质 在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量的大 小。
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Western blot一、Western blot历史及原理蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，简称WB。
1975年，继Edwin Southern发明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事发明的“Northern Blot”技术之后，受以上两个“转印”技术的启示，1981年“Western Blot”这一技术正式问世。
抗体技术的发展，电泳及转膜技术的改进使得Western Blot操作日益简单；分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得Western Blot的检测范围得到扩展，定量/半定量成为可能。
目前Western Blot设备不断更新、技术不断发展，WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用，其检测灵敏度也将不断提高。
其基本原理与ELISA相似：通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离混合蛋白质样品，转印到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。
以转印到固相载体上的蛋白质（多肽）作为抗原，与对应的抗体（又称一抗）特异性结合，特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体（又称二抗）起反应，经过底物显色或放射自显影以检测样品中特异性蛋白（见图1）。
一抗的质量是WB成功的关键，现在市面上抗体公司很多，一般选择大公司大品牌的抗体对于实验的成功很有保证。
但是由于实验经费的限制只能选择小公司或国产二线品牌的抗体，这个时候需要使用者尽可能多考究：①完整的质检数据；②售后承诺；③技术人员对产品的熟悉程度。
对于二抗来说，选择就更需谨慎，虽然二抗看似简单，其质量却千差万别，对实验结果的影响也尤为重要。
福因德科技（Frdbio）专注于免疫检测产品的开发和工艺研究，只做精品；如果客户购买的产品质量达不到标明的水平，无条件退货。
对于WB的底物是根据二抗的标记酶来确定的，有大家较为熟悉的辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase，不同的酶对应的底物当然也不同，并且底物被催化后应该是不扩散不溶解的图1.Western blot 原理示意图Western blot的主要流程如下：样品制备总蛋白质的定量 SDS-PAGE电泳转膜封闭一抗孵育二抗孵育加底物，显色/显影，定影/化学发光，下面将对这些步骤详细介绍。
二、Western blot操作流程在熟悉原理之后实验人员可以根据操作流程轻松开展实验，下面主要介绍关于Western blot的主要操作流程。
⒈样品制备：⑴动物细胞总蛋白的提取：细胞都含有一个保护细胞不受外界环境干扰的细胞质膜，细胞质膜主要由磷-脂双分子层组成。
两性的脂质形成的等离子体膜在具有亲水基团的同时也含有疏水性基团，从而自发的形成一个封闭的双分子层壁。
膜蛋白嵌入在脂质双分子层,横跨疏水区，也就是说细胞膜主要由脂质和蛋白质组成，但其各成分的比例则是随细胞类型及生物种属的不同而对应变化。
实验中提取细胞蛋白用到的裂解液中含有的表面活性剂如Triton-100、NP-40、SDS等，能够插入并破坏细胞膜的磷脂双分子层，从而达到细胞裂解的目的。
这一类裂解液商品化的有很多，比如福因德科技研制的Western及IP细胞裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0104）等。
在蛋白提取过程中尽量冰上操作以防止蛋白降解，也可适量加入蛋白酶抑制剂PMSF，福因德科技(Frdbio)可提供效果较好的蛋白酶抑制剂（Frdbio,Cat No.WBR0114）。
对于加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除收集贴壁细胞外还应收集培养液中的细胞。
⑵细菌及植物组织总蛋白的提取：对于动物细胞来说质膜是其唯一的保护屏障，但是在植物细胞和细菌的质膜外还有一层坚硬的细胞壁存在。
细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，由n-乙酰葡萄糖胺和n-乙酰胞酸两种氨基糖经β-1.4糖苷键连接间隔排列形成的多糖支架。
而溶菌酶可以水解这一糖苷键从而达到裂解细胞的目的。
对于细菌的裂解可以用含有一定浓度溶菌酶的PBS缓冲液（TE,pH8.0）即可。
而植物细胞壁主要由纤维素和果胶组成的，这为植物细胞赋予了细胞形状和刚度。
对于植物组织蛋白的提取目前多用机械破坏法如液氮研磨或化学法如三氯醋酸-丙酮沉淀法或TCA丙酮沉淀法；⑶对于需要提取特殊亚细胞结构的蛋白如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白、细胞膜蛋白等，由于操作比较麻烦，可以选用商业化的试剂盒，例如福因德科技(Frdbio)研制的核蛋白提取试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0106）与线粒体蛋白提取试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0109）、细胞浆蛋白提取试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0108）。
⒉总蛋白质的定量：提取样品的总蛋白后需要对提取的蛋白作定量分析，以便于电泳时上样量的把握。
目前蛋白定量主要有Lowry法、BCA法（Frdbio,Cat No.WBR0202）、沉淀法、Bradford法（Frdbio,Cat No.WBR0204）等，任何定量都需要选一个标准蛋白作为定量依据，绘制标准曲线，常用的且方便可靠的就是BSA（牛血清蛋白）。
⑴制作标准曲线一般选用BSA来制作标准曲线，作为定量标准用的BSA（Frdbio,CatNo.WBR0205），其纯度和理化性质必须相当的标准。
配制一定浓度的BSA标准溶液，按需求进行梯度稀释，然后根据各种定量方法测定器数值，绘制标准曲线。
福因德科技（Frdbio）有作为定量专用的BSA溶液提供（Frdbio, CatNo.WBE0205），商业化的蛋白定量测定试剂盒中都有标准BSA配置。
⑵蛋白含量的测定蛋白含量测定的方法有多种，例如Lowry法、BCA法、沉淀法、Bradford 法，但目前相对于另外两个来说BCA法和Bradford法使用较多。
在裂解细胞时使用的裂解液若是Western及IP细胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0104）等，则可选用福因德科技（Frdbio）的BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（Frdbio,Cat No.WBR0202）、BCA蛋白定量试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0201）或Bradford蛋白浓度测定试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0204）搭配使用，但不同的试剂盒测定精确度不同，可根据实验需要进行选择，客户可根据实际需要登陆我们网站查询相关产品说明书。
⒊SDS-PAGE电泳⑴制样上样总体积一般不超过15μl，上样前将样品与上样缓冲液按要求混合后沸水中煮5 min使蛋白变性后立即冰浴。
一般使用的是5×上样缓冲液和2×上样缓冲液，5×上样缓冲液的配置方法是：250mM Tris-HCl(pH6.8)、10%(W/V)SDS、0.5%(W/V)、0.5%(W/V)溴酚蓝、50%(V/V)甘油、5%(W/V)β-巯基乙醇。
2×上样缓冲液的则在5×的基础上各含量减半。
为节约科研工作者的时间和精力，可选择福因德科技（Frdbio）的商品化上样缓冲液，可选择5×的蛋白上样缓冲液（Frdbio,Cat No.WBR0304A）和2×的上样缓冲液（Frdbio,Cat No.WBR0304B）。
⑵制胶聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N，N- 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，具有分子筛效应。
它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）,没有加变性剂如SDS，电泳过程中蛋白质保持完整的天然状态，蛋白在其中依三种因素进行分离：蛋白大小，结构和电荷；另外一种是变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）,在样品和凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白的二、三级结构被破坏，加入的SDS与蛋白结合后使得蛋白带有很强的负电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，最终蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小和凝胶分子孔径排阻效应。
对于待检蛋白活性有较高要求的实验中，一般选用Native-PAGE，因为非变性胶在分离蛋白后对蛋白的活性并没有明显的影响，例如EMSA。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时，要用低pH凝胶系统，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
分离酸性蛋白时候，要利用高pH（8.8）凝胶系统，蛋白会带负电荷向阳极移动，SDS -PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，由浓缩胶（上层胶）和分离胶（下层胶）组成，当电泳开始后，电泳开始时缓冲液中的氯离子泳动最快,甘氨酸根离子最慢，因此在中间形成低电导区，使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一个狭窄的区带。
在进入分离胶后蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动，从而达到分离蛋白的目的。
蛋白分子量不同，所适用生物SDS-PAGE浓度也会对应不同，下表是聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）和对应的蛋白质分离范围（kD）配制的凝胶质量对电泳条带的清晰度以及背景有着密切的影响，灌胶前玻璃板一定要洗干净并且用吸水纸擦干；灌胶时不能有气泡；凝胶要彻底才能点样电泳。
另外制胶的药品丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在溶解后有毒，因此在制胶过程中一定要小心，注意安全。
现在为方便科研工作者，已经有商业化的SDS-PAGE凝胶试剂盒，例如福因德科技（Frdbio）的SDS-PAGE凝胶试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0401）。
⑶电泳当样品处在浓缩胶中时电压不宜过高，可将电压调在80V，在电泳大概30min左右，蛋白进入分离胶中，此时可稍微调高电压至120V。
电泳过程中由于系统会产热，为得到较好的结果电压不宜过高，但是为节约时间也不能太低，以上是经过实验总结出的较好的电压选择。
为方便观察电泳效果和转膜效果以及判断蛋白分子量大小，最好使用彩色预染蛋白分子量标准（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。