自我总结的Westen Blot步骤
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
western blot实验流程(自己整理)
Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。
中间打开盖子1~2次。
6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。
玻璃板内侧液面高于外侧。
然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。
上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。
通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。
电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。
电泳时间根据具体情况定。
7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。
按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。
2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
自己整理的western blot步骤
组织蛋白质抽提取-80℃冰冻的大鼠大脑皮质、海马组织，1mg组织加10ulRIPA，并加入蛋白酶抑制剂cocktail，加入PMSF，用电动匀浆器低速匀浆30秒，至组织完全裂解。
冰上孵育30min。
之后离心(4℃，12，000xg离心20分钟)，吸取上清，移至新的冻存管中置于-80℃冰箱保存待用。
样品变性：取预冷的25ul 5×SDS加样缓冲液加入100ul样品中，混匀，煮沸10min。
SDS-PAGE电泳（根据分子量选择不同的胶浓度）分离胶浓缩胶灌胶、上样：取一套干净的玻璃板（0.75mm），擦拭干净，按次序放置，用固定夹夹好，固定在制胶架上。
将分离胶5 ml(or 10 m1)灌入约2/3，加水或无水乙醇或异丙醇或SDS（0.1%）或正丁醇压实，待凝后（20--30min），倒出水，滤纸吸干；将配好的2ml积层胶灌入，将梳子插入，待凝后拔出梳子。
装入电泳槽内，梳子面朝里，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，内液面略高于外液面，拔出梳子，按预定顺序加样，每样品加20ul。
设预染Marker孔。
将电泳装置与电源相接，红对红，黑对黑。
凝胶上所加电压80V，当染料前沿进入分离胶后(30min)，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝刚跑出来，关闭电源。
转膜：6张滤纸l张硝酸纤维素膜把凝胶转移到一盘转移缓冲液中略为漂洗，滤纸、垫片、夹子、膜也浸入其中转膜叠放顺序：白色板-三层海绵-3层滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-3层滤纸-三层海绵-黑色板黑对黑，白对红，连接电源，0.33A（0.8～3.0mA/cm2），90min。
转膜槽放在冰中。
转膜完毕断开电源从上到下拆卸转移装置，用镊子（防手上蛋白污染膜）逐一掀去各层丽春红检测：用丽春红检测有无条带，用TBST冲洗直至红色条带消失封闭：封闭液（含10%脱脂奶粉的TBST）封闭2h，室温，一般20～24℃TBST稍微洗一下或不洗即可进行抗体孵育一抗孵育：适宜稀释倍数一抗（一般用TBST稀释，含2%的BSA（牛血清白蛋白,为终浓度））孵育置于湿盒中，4℃冰箱孵育过夜（12h以上），或室温孵育3h，均在摇床上TBST洗膜10mi n×3次二抗孵育：适当稀释倍数HRP标记的二级抗体，置于湿盒中，室温孵育2hTBST洗膜10mi n×3次抗体孵育及TBST漂洗过程都在摇床上进行。
WesternBlot操作流程
WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。
由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。
⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。
（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。
Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。
Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。
2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。
--Western blot 详细步骤(中文版)
Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。
2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。
2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。
倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。
3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。
4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。
6.接通电源，积层胶电压为60V。
7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。
8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。
9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。
11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。
12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。
13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。
14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
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自我总结的Westen Blot步骤，简单实用！
蛋白质的提取
（整个过程冰上进行）
一．组织膜蛋白
裂解液bufferA+1%蛋白酶抑制剂
蛋白保存液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min
3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平
4.差速离心33000-35000转（45000g）30min
5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫
6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存
二．组织总蛋白
裂解液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min
3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存
三．细胞总蛋白
裂解液RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS
2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中
3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右
4.重复上步4-6次
5.4°C离心13500转15min
6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。
蛋白质浓度的测定
工作液（BCA试剂B液：BCA试剂A液=1：50）
1.用100枪将19μl PBS加入96孔板（两边不加，测浓度不准）
2.用2.5枪加入1μl待测样品（加样时枪头在液面下，提抢时贴壁，尽量不产生气泡)
3.用200枪加入200μl工作液，混匀（枪头在液面下，不产生气泡）
4.放入37°C孵箱30min
5.用酶标仪测浓度，记录数据
凝胶的配置
一．分离胶的配置：
1. 将胶板用自来水冲洗干净（否则配出的胶会不均匀），用去离子水冲洗。
将胶板固定在架子上，加入去离子水至矮板高度，等待3~4分钟，测试是否漏水。
期间可以准备配胶时所需要的溶液：
去离子水：室温放置
30%丙烯酰胺：4℃放置，神经毒性
TRIS—HCL（ph8.8）：4℃放置
TRIS—HCL（ph6.8）：4℃放置
10%SDS（自配）：室温放置
10%AP（现配现用）：避光
TEMED：室温放置，神经毒性
2. 根据所需蛋白质的分子量确定所要配制多大浓度的胶。
本实验采用的胶为10%的分离胶，2块胶版配置25ml即可。
按照如下的量进行配制分离胶：
去离子水：9.9ml
30%丙烯酰胺：8.3ml
TRIS—HCL（ph8.8）：6.3ml
10%SDS（自配）：0.25ml
10%AP（现配现用）：0.25ml
TEMED：0.01ml
配置时要将液体混匀，加入最后两种物质的速度要快，因为丙烯酰胺是促凝剂，凝聚的物质为APH和TEMED。
将配好的分离胶倒入胶板中（倒入量为胶板高度的3/4）加入去离子水封住，防止空气进入，排除气泡。
加去离子水时要轻，防止将上层的分离胶稀释。
通常分离胶需要30~35分钟即可，凝固后可以看到用一条直线。
3. 在配好的分离胶上层加入TRIS—HCL（ph6.8）作为一种缓冲，因为积层胶用的是TRIS—HCL（ph6.8）。
然后配制积层胶：
去离子水：5.5ml
30%丙烯酰胺：3.5ml
TRIS—HCL（ph6.8）：1.5ml
10%SDS（自配）：0.08ml
10%AP（现配现用）：0.08ml
TEMED：0.008ml
配好后将TRIS—HCL倒出，倒入积层胶，插入梳子（梳子要用去离子水冲洗干净，并将去离子水甩掉，否则会在胶板上留下不能用的孔道），插梳子的时候要排除气泡，从一端向另一端推。
20分钟即可凝固，拔出梳子。
将配好的胶板放入装有去离子水的饭盒中，防止胶中的水分蒸发，发生缩胶现象。
电泳液和转膜液的配制
1. 电泳液：Gly15.0g，Tris-base3.02g，SDS1g，1000ml 去离子水，室温保存
2. 转膜液：Gly14.4g，Tris-base
3.00g，甲醇100ml，900ml去离子水，4℃保存
蛋白质样本的处理
1. 从-80℃冰箱中取出提好的蛋白质，按照算好的蛋白，ripa,loading将蛋白稀释到同一个体积。
（此操作过程在冰域中进行）
蛋白质的体积X= 40μg/[（1.3484*O D值-0.0799）*20]
Ripa的体积Y=体积最大的蛋白质补整-X
Loading的体积Z=1/4(X+Y)
2. 煮样：100℃，5min。
（将管外的水擦干净）
电泳过程
1. 将电泳槽准备好，胶板的矮面朝里，加入电泳液，先在里面和外面个加入一半的电泳液，排净气泡后加满。
2. 上样，上样量为8μl。
上样时要慢，如果担心样的中央处有凹陷，那就在边处让样流下。
3. 按照“红对红，黑对黑”的原则安装电极。
开始跑电泳。
先恒压70v使蛋白质跑到同一条起跑线上，待跑至分离胶上时，改为100v，使溴酚蓝全部跑出时停止。
电压越小跑的越好。
转膜过程
1.剪好滤纸和NC膜，滤纸要比膜小1~2cm，在转膜液中浸泡。
2.准备白色的矮一些的盒子，里面装好转膜液，将膜取下，取得过程中要注意不要将膜弄破。
3.制作“三明治”，夹板黑色的一面朝向桌子，第一层为海绵，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为滤纸，这时不要急于将最后一层海绵盖上，先将前面三层中的气泡赶走，然后再加入第五层海绵。
夹紧，不要让夹板扭动。
4.放入“三明治”时要按照“黑对黑”的原则放入。
在倒满转膜液之前不要忘记将一个冰盒放在转膜槽内。
将转膜槽放在装满冰的盆里，开始转膜。
我们需要的分子量范围是：>250kd~31kd，我们转膜的条件为恒压70v，2h。
封闭
1. 封闭液的配制（5%）：将10g脱脂奶粉加入到200mlPBS中，在漏斗中过滤。
2. 将膜取出，放在去离子水中冲洗一下，放入封闭液中。
3. 放在摇床上封闭2h。
一抗的孵育
1. 将膜从封闭液中取出，用PBS冲洗3次，每次10min。
按照分子量将膜剪开。
2. 一抗有两种孵育方法：一、室温孵育：在桌面上铺一张纸，将剪好的膜放在纸上，加上相应的一抗。
二、过夜孵育：准备夹链袋，将膜用镊子放入，但是不能碰到膜的表面，将抗体加入，不能有气泡。
在室温下摇动1h（可以将枪按到一档）4℃过夜。
3. APP(1:200),Navβ2（1：200），Nav1.2(1:200),NR1(1:200),BACE1(1:1000),GA PDH(1:1000)
二抗的孵育
1. 将膜从夹链袋中取出,一抗回收放在PBST中冲洗3次，10min一次。
2. 二抗在暗室中进行，GAPDH二抗用800鼠（1：4000），其他用700兔（1：4000）。
3. 二抗孵育1h。
4. 洗膜：PBST冲洗3次，每次10min。
最后再用PBS冲洗一次。
扫膜。