荧光法研究曲克芦丁和

荧光法研究曲克芦丁Leabharlann 人血 清白蛋白的相互作用摘要：
目的：研究曲克芦丁(Troxerutin)与人血清白蛋白 (HSA)的相互结合作用。 方法：以HSA为荧光剂,Trox-erutin为荧光猝灭剂,在 激发波长为220 nm,发射波长为345 nm下测定两者结 合后的荧光强度,推测其猝灭机理;分别测定相同浓度的 HSA的荧光发射光谱图和紫外可见吸收光谱图,来推断 两者结合的作用力类型。 结果：Troxerutin与HSA的相互作用为静态猝灭过程, 平衡常数K0(25℃)=6· 18×105L/mol、K0(37℃)= 3· 76×105L/mol,供体(HSA)与受体(Troxerutin)间的 作用距离r=4· 66 nm。Troxerutin和HSA的作用力类 型为疏水作用力。 结论：通过两种分析方法清楚的研究了曲克芦丁与血 清白蛋白的相互作用。

曲克芦丁(Troxerutin)是一种重要的黄酮类化合 物,它是羟基芦丁中最重要的有效成分,医药上用 于治疗静脉障碍血栓症及脑血管疾病。最近几 年国外把曲克芦丁应用于防治长途飞行引起的 微血管病，使曲克芦丁临床研究拓展到新的领 域。药物进入体内一般都需要通过血浆的储存 和运输来到达受体部位,发生药理作用。血清白 蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白,可与许多 内源及外源性化合物结合。因此,研究药物与白 蛋白的相互作用,具有重要的理论和现实意义。
讨论
随着我国社会经济的发展,人们的生活水平和营养知识 水平逐步提高,天然食品、绿色食品、无公害食品、营 养饮食等已成为人们日益关心的问题。但是,目前大学 生的营养知识还是相当贫乏,营养知识的宣传工作开展 得较少,有待加强。本次调查结果,某医学院学生营养知 识较缺乏,营养调查总分女生高于男生;营养知识评分不 及格率临床医学专业学生高于护理专业学生,护理和临 床医学专业学生的营养态度得分和饮食行为得分基本相 同;营养知识来源主要是报刊和书籍,这与有关报道相似。 护理专业学生的营养调查总评分与营养知识得分高于临 床医学专业学生,可能是护理专业学生毕业后主要从事 护理工作,接触和护理病人时将向病人宣传营养知识及 营养与疾病、营养与治疗疗效等,因此特别注意学习营 养知识。医学院校应加强营养教育,开设营养学或临床 营养学课程,为医学生毕业后在工作中向病人宣传、指 导营养知识及对病人进行营养治疗打下基础。
结果：
曲克芦丁与人血清白蛋白的相互结合反应
蛋白质中由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的 存在使其具有内源荧光(λex/λem=225 nm /345 nm),随着曲克芦丁浓度的增加,HSA的 内源荧光强度有规律地降低,且激发峰与发射 峰的峰位与峰形均不变,如图1,说明曲克芦丁 对HSA的荧光有猝灭作用。
求算曲克芦丁与HSA的结合数n、平衡常数K0
对于静态猝灭过程,荧光强度与猝灭剂的关系可 由荧光 分子与猝灭剂分子之间的平衡常数表达 式推导求出lg((F0-F)/F)=lgK0+nlg[Q] (2)式中F0 为猝灭剂不存在时的荧光强度,F为加入猝灭剂 后的荧光强度, K0为结合平衡常数,[Q]为猝灭剂 浓度。由图1统一读取225 nm/345 nm处的荧 光强度,按(2)式进行数据处理。得到拟合的曲线 方程,平衡常数及结合数,曲克芦丁与人血清白蛋 白结合数n约等于1,说明每一个HSA分子与一个 药物分子结合形成配合物。结果见表2。
曲克芦丁和HSA作用距离计算
药物分子与血清白蛋白结合形成配合物, 根据偶极-偶极非辐射能量转移理论即 F0rster理论，可以求出结合位置与蛋白 质分子中发荧光基团之间的距离r,距离越 小,药物分子越有利于被蛋白质存储与转 运,越能发挥其药理作用。
将曲克芦丁的吸收光谱和人血清白 蛋白的荧光光谱重叠部分见图2,参 照文献[2]方法求得光谱的重叠积 分J,进一步求得能量转移效率E,药 物距色氨酸残基最短距离r,r均小于 7 nm,说明药物容易被蛋白质携带, 发挥其药力作用,药物与HSA作用 过程发生了非辐射能量转移,两者 形成了复合物。也进一步证明了药 物对HSA的荧光猝灭属静态猝灭。 见表3
HSA与曲克芦丁作用力的推测
药物与生物大分子之间的作用力包括氢键、Van der Waal力、 静电引力、疏水作用力等,药物不同,与蛋白质作用力类型也不同。 根据热力学公式可以得到结合反应的△G、△H、△S等热力学 函数的变化值,Ross等根据大量的实验结果,总结了判断生物大分 子与小分子结合作用力类型及生物大分子自身作用力类型的热力 学规律。由此,药物与HSA结合过程的△G<0、△S>0,表明其作 用过程是一个熵增加,自由能降低的自发分子作用过程。由于ΔH、 ΔS均大于零,推测其主要作用力为疏水作用力。结果见表4。
荧光猝灭机理可分为动态猝灭和静态猝灭,动态 猝灭是一种能量转移或电子转移过程,不影响蛋 白质的结构和生理活性。静态猝灭则是由于发 生了配合作用,通常是产生了不发荧光的配合物, 对蛋白质的二级结构可产生影响,并可影响其生 理活性。若猝灭过程为动态猝灭,则应符合 Stern-Volmer方程：F0/F = 1 + Ksv[Q] (1) 式中:F0为未加猝灭剂时的荧光强度,F为加入猝 灭剂后的荧光强度,[Q]为猝灭剂浓度,Ksv为 Stern-Volmer动态猝灭常数,实验测定了HSA 的荧光强度F0/F随曲克芦丁浓度的变化。由于 生物大分子的最大的动态猝灭过程的速率常数 Ksv<100,因此猝灭速率常数大于100 L/mol的 荧光猝灭过程为静态猝灭过程。结果见表1。
本文在模拟生理条件下,用荧光光谱法和 紫外吸收光谱法,从分子水平上研究了曲克 芦丁与人血清白蛋白(HSA)相互作用,并计 算了其平衡常数及结合点位。根据能量转 移机制计算了两者结合时的作用距离,推测 了二者之间的主要作用力。
实验部分
原理：
蛋白质具有内源荧光,可作为能量予体与某些药物受体 发生反应形成络合物,从而猝灭内源荧光。研究这种猝 灭行为可以为研究荧光能量予体与药物受体之间的作用 提供一系列理论依据。同时荧光能量给予体与受体分子 间可发生非辐射能量转移,而这种能量转移过程效率决 定于供体的发射光谱与受体的吸收光谱两者重叠的程度。 重叠的程度越大,能量转移的效率越高。因此,能量转移 的几率是供体的发射光谱与受体的吸收光谱两者重叠程 度的函数。基于荧光和紫外可见吸收光谱两种分析方法 , 本文研究曲克芦丁与人血清白蛋白的相互结合作用。
实验方法
加入1×10-5mol/L的HSA 1.0ml,一定量4× 10-4mol/L的曲克芦丁溶液,1.0 mol/L的NaCl溶 液1.0 ml(用以维持体系中的离子强度)及pH = 7.40的Tris-HCl缓冲溶液1.0 ml于10 ml比色管 中,以蒸馏水定容至刻度,25℃恒温2 h。以1 cm 石英比色皿保持25℃恒温,在激发和发射狭缝宽 度均为5 nm,λex为225 nm,测定荧光强度。按 上述操作,37℃恒温2 h同样测定。 移取1.0ml4×104mol/L的曲克芦丁溶液于 10ml比色管中,加入pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶 液定容至刻度,以Tris-HCl缓冲溶液做参比,测定 紫外吸收光谱。