单链抗体表达研究进展_邓亮

scFv 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 形 式 主 要 有融合表达、胞内表达、分泌表达三种。 分泌表达是常用的表达方式， 在信号肽 Mel、Om-pA、PelB、PheA 的 引 导 下 ，scFv 被分泌至大肠杆菌外周质或培养液中， 并完成二硫键的形成和肽链折叠， 成为 有 活 性 的 可 溶 性 表 达 产 物 。 Strube 等 通 ［１７］ 过 将 scFv 和 Fc 片 段 融 合 ， 构 建 了 scFvFc 融 合 胞 内 小 体 ， 发 现 可 以 降 低 细 胞 内 表 达 scFv 蛋 白 的 不 稳 定 性 ， 而 维 持 亲 和 力不变。 无论是融合表达、胞内表达、分 泌表达， 还是降低培养温度、 改变诱导物 IPTG 的浓度，表达产物都是以包涵体形式 存在。 包涵体需要经过溶解、变性、复性，最 终才能获取有活性的 scFv 蛋白，包涵体溶 解的方法主要有超声破碎和酶溶 。 ［１８］ ５ 结语
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实 用 医 学 杂 志 ２００９ 年 第 ２５ 卷 第 ２ 期
功至关重要。 针对磷酸钙共沉淀法低产 量 、 低 转 染 效 率 的 特 点 ，Olton 等 ［１３］ 报 道 了 单 分 布 CaP-Pdna 粒 子 合 并 优 化 Ca ／ P 比 率 的 方 法 来 提 高 效 率 ，当 Ca ／ P 比 率 介 于 １００ ～ ３００ 时 可 达 最 大 的 转 染 效 率 。 ３．２ 电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露 在短暂的高场强电脉冲中， 细胞悬浮液 置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差 异， 这种电压差异会导致细胞膜暂时穿 孔 ，外 源 性 DNA 可 通 过 穿 孔 处 进 入 细 胞 内 。 ［１４］ 电 脉 冲 和 场 强 的 优 化 对 于 成 功 的 转染非常重要， 因为过高的场强和过长 的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而 裂解细胞。
Hamasaki 等 ［７］报 道 了 一 种 新 改 进 的 免 疫 胶 体 分 子 筛 技 术 （immunogelbiopanning）。 新 改 进 immunogelbiopanning 技 术 有 两 个 特 征 ：（１） 在 蛋 白 电 泳 后 进 行 胶 体 切 片 ，使 用 immunoplates coate 将 不 同 片 断 带 的 蛋 白 洗 提 ；（２）通 过 使用噬菌体克隆作为探针， 产物对目标 分子的敏感性的检测经生物学放大可以 极大提高。
Auf der Maur 等［８］能 够 在 还 原 环 境 下 保 持 稳 定 ， 并 且无论在细胞内还原环境还是细胞外的 正常环境下都表现出较高的生化稳定 性、可溶性、抗原识别能力。
Emadi 等 ［９］ 将 噬 菌 体 表 面 呈 现 展 示 技 术 和 原 子 动 力 显 微 镜 （atomic force microscopy） 生 物 筛 选 技 术 结 合 成 一 种 新 的生物淘筛技术， 仅使用最小量的目标 抗原， 就能够筛选特异性结合 α－ synuclein 的 scFv。
作 者 单 位 ：５１０２２０ 广 州 市 红 十 字 会 医 院消化内科
因区， 使外源多肽或蛋白质表达并展示 于噬菌体表面， 进而通过亲和富集筛选 表达有特异肽或蛋白质的噬菌体， 并得 到 大 量 富 集 ， 然 后 进 行 DNA 序 列 测 定 。 它将基因型、表型、分子结合活性与噬菌 体的可扩增性结合在一起， 是一种高效 的 筛 选 系 统 ［５］。
（收 稿ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ：２００８－０７－０８ 编 辑 ：徐 荣 远 ）
单链抗体表达研究进展
邓亮 综述 舒建昌 审校
单 链 抗 体 （single-chain antibody fragment， scFv） 由 抗 体 重 链 可 变 区 和 轻 链 可 变 区 通 过 １５ ～ ２０ 个 氨 基 酸 的 短 肽 （linker）连 接 而 成 。 在 目 标 特 定 的 scFv 上 连接放射性核素、生物毒素、药物，将极 大 增 强 对 靶 细 胞 的 杀 伤 能 力 。 Kanter 等［１］ 研 究 发 现 将 个 体 基 因 型 scFv 和 细 胞 因 子 粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子或免疫 刺激肽组成融合蛋白， 是一种有效治疗 淋 巴 瘤 的 疫 苗 。 Wang 等 ［２］通 过 抗 脱 氧 雪 腐 镰 刀 菌 烯 醇 （DON）和 抗 单 端 孢 霉 毒 素 （ZEN）scFv 基 因 融 合 ， 表 达 为 抗 DON 和 抗 ZEN scFv， 结 果 显 示 双 功 能 抗 体 成 功 构 建 ，并 可 应 用 于 DON 和 ZEN 检 测 。
Bejjani 等 ［１５］研 究 发 现 短 暂 而 高 强 度 的电流脉冲能获得更高的寡核苷酸序列 和质粒的转化效率， 这种方法能安全有 效地在体外进行目标基因转化， 而离子 渗透法则只对分子量小的核酸片段 （如 SiRNA）有 转 化 作 用 。 ３．３ 脂质体法 脂质体介导的细胞转染 主 要 是 通 过 脂 质 体 DNA 复 合 物 与 细 胞 融 合 而 将 DNA 导 入 细 胞 ，使 用 该 方 法 达 到的转染效率较高， 但只能转染分子量 大 的 抗 体 ，适 用 性 不 广 。 钱 锋 等 研 ［１６］ 究 发 现 脂 质 体 DNA 复 合 物 对 细 胞 有 毒 性 ，随 着 DNA 量 增 加 以 及 DNA－脂 质 体 复 合 物 作用时间延长，细胞毒性逐渐加重，细胞 存活率下降，转染效率降低。 ４ 表达形式
１．３ 腺病毒载体 腺病毒由于其基因结 构、功能清楚，易于制备、纯化、浓缩，宿 主范围广、感染率高、理化性质稳定、不 整合宿主基因组、 遗传毒性和免疫毒性 低 的 特 点 。 Ad２ 和 Ad５ 是 目 前 应 用 最 广 的 两 种 腺 病 毒 血 清 型 。 Hedley 等 ［１０］将 腺 病 毒 和 ５６６FF-scFv 重 组 ， 并 转 染 ２９３T ／ １７ CHO 细 胞 （中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 ），发 现 ５６６FF-scFv 准 确 转 染 入 CHO 细 胞 并 且 获 稳定表达。 ２ 表达载体受体
目 前 常 用 的 噬 菌 体 载 体 为 pComb３ 及 Pcantablf， 组 成 噬 菌 体 抗 体 （phage antibody）库 ，库 中 每 一 个 噬 菌 体 在 其 表 面 可 表 达 一 种 特 异 性 抗 体 （Fab 或 scFv）。 由 于噬菌体抗体既可以识别相应抗原并与 其结合，又能够感染宿主菌进行扩增，重 复“吸附－洗脱－扩增”过程，可筛选容量 为 １０８ 以 上 的 噬 菌 体 抗 体 库 。
Lee 等 ［６］ 利 用 噬 菌 体 表 面 呈 现 技 术 和 抗 体 库 技 术 ，将 SARS-CoV 蛋 白 免 疫 小 鸡 后 ， 提 取 脾 B 淋 巴 细 胞 ５ × １０７ 个 克 隆 ， 数 轮 Panning 淘 筛 、 洗 脱 、 富 集 后 ， 抗 体 数 量 增 加 １０ 倍 ，发 现 独 特 scFv 表 达 噬 菌体和噬菌体表面呈现系统结合可以提 高 scFv 的 产 量 和 亲 和 力 。
实 用 医 学 杂 志 ２００９ 年 第 ２５ 卷 第 ２ 期
［２２］ Kaya R A， Aydin Y． Modified transpedicular approach for the surgical treatment of severe thoracolumbar or lumbar burst fractures ［J］． Spine，２００４，４
scFv 表 达 是 scFv 制 备 的 关 键 步 骤 。 将基因通过表达载体整合入受体宿主基 因 内 ， 依 靠 宿 主 的 转 录 和 翻 译 系 统 ，scFv 片 断 完 整 表 达 于 产 物 中 。 本 文 将 就 scFv 表达技术及其进展做一综述。 １ 表达载体
常 用 的 scFv 表 达 载 体 包 括 ： 质 粒 载 体、噬菌体载体、腺病毒载体等。 １．１ 质 粒 载 体 质 粒 （plasmid）是 以 超 螺 旋状态存在于细菌细胞质中的一种能够 自主复制的遗传成分， 多以共价闭合环 状的 DNA（covalently closed circular DNA） 分 子 形 式 存 在 ［３］。 质 粒 载 体 借 助 于 物 理 或 化学的作用导入细胞内，依据质粒在宿 主细胞内是否具有自我复制能力分为 整 合 型 和 附 加 体 型 两 种 。 Jurado 等 ［４］以 Sigma-５４ 依 赖 的 分 解 性 TOL 质 粒 为 表 达 载 体 ，在 M１３ 噬 菌 体 文 库 中 表 达 的 scFV 含量增高且与受体结合活性增强。 １．２ 噬菌体载体 噬菌体表面呈现展示 技 术 （phage display techniques）， 是 近 年 来建立和发展的利用噬菌体表达外源基 因的一项新技术。 它以改建的噬菌体为 载体， 将编码外源肽或抗体可变区的 DNA 片 段 定 向 插 入 噬 菌 体 外 壳 蛋 白 质 基
基因转染技术主要有磷酸钙共沉淀 技术、电穿孔方法、脂质体法。 ３．１ 磷 酸 钙 共 沉 淀 技 术 将 氯 化 钙 、 RNA （ 或 DNA） 和 磷 酸 缓 冲 液 混 合 ， 沉 淀 形 成 包 含 DNA 且 极 小 的 不 溶 的 磷 酸 钙 颗 粒 。 磷 酸 钙－DNA 复 合 物 黏 附 到 细 胞 膜 并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。 沉 淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成
scFv 的 表 达 载 体 受 体 多 种 多 样 ， 有 细 菌 、真 菌 、动 物 细 胞 （COS 细 胞 、CHO 细 胞、昆虫细胞）、植物细胞等。
最 常 用 的 表 达 受 体 为 大 肠 杆 菌 （E． coli），大 肠 杆 菌 作 为 表 达 受 体 表 达 具 有 生 长快速、易于操作、转化和转导效率高，可 在短时间内大规模地生产抗体蛋白，便于 纯化、分析和应用。 然而，大肠杆菌不能对 重组抗体进行翻译后的糖基化、磷酸化修 饰，不能完成多聚体的组成和二硫键的形 成 。 在 植 物 中 表 达 的 scFv 通 常 称 为 植 物 抗体（plantibody）。 Brereton 等 通 ［１１］ 过 基 因 枪 轰 击 转 基 因 商 业 小 麦 Westonia， Westonia 能 表 达 大 鼠 胸 腺 表 面 CD４ 和 CD２８ 两 种 scFv，成 熟 的 种 子 保 存 １ 年 后 scFv 仍 保 持 较 高 活 性 ， 转 基 因 种 子 提 取 的 scFv 具 有 内 毒 素 污 染 小 、 易 于 纯 化 和 收 集 。 Putalun 等 针 ［１２］ 对 药 用 植 物 喀 西 中 的药理活性成分澳州茄碱糖苷 （solasodine glycosides） 制 备 了 单 克 隆 抗 体 ，通 过 载 体 转 化 发 根 农 杆 菌 插 入 Ri 质 粒 T-DNA 中 感 染 喀 西 茄 植 株 ， 诱 导 scFv 在毛状根表达。 ３ 基因转染技术