第十八章 经典液相色谱法
经典液相色谱法
例：在薄层板上分离A、B两组分的混合物，当原点至溶剂前沿
距离为16.0 cm 时，两斑点质量重心至原点的距离分别为 6.9 cm 和5.6 cm，斑点直径分别为0.83 cm 和0.57 cm。 求两组分的分离度及Rf 值。 解：
2d 2 (6.9 5.6) R 1.9 W1 W2 0.83 0.57
一般低温展开效果较好 温度 物质极性
•
展开剂极性 展开剂极性↑ Rf 极性物质Rf ↑ 亲脂性组分Rf ↓ 展开剂蒸气
极性大，Rf小 极性小，Rf大
•
对Rf 影响较大，应先让溶剂蒸气将层析缸饱和
例:用纸色谱分离，正丁醇为流动相，比较下面三个化合物的 Rf
CHO HC HO CH HC HC OH OH OH
1 Rf 1 k
k (1 Rf ) / Rf
Vm: 薄层板的死体积; K: 该条件的分配系数
VS: 板固定相体积;
在色谱条件确定的情况下，K大Rf 小，K小Rf 大。
分离物质性质 薄层板性质 Rf 影响因素 展开剂极性 温度 展开剂蒸气饱和程度
(2) 相对比移值 (retardation factor, Rr ) 某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现性差。 可用相对比移值定性。
5.6 0.35 16.0
Rf,A
6.9 0.43 16.0
Rf,B
四. 薄层色谱法
点样
展开
过程：铺板→活化→点样→饱和→展开→显色→定性定量
1. 原理:
将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一端, 在密
闭容器中用适当的溶剂 (展开剂、流动相) 展开, 各组分不断 地被吸附, 解吸附… 随展开剂前移, 利用吸附剂对不同组分 的吸附力 (吸附常数)不同, 产生差速迁移, 而达到分离。
经典液相色谱法 ppt课件
和薄层色谱。
ppt课件
3
1.2 吸附色谱法的依据
吸附过程的两个规律： 1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 平衡,存在一个吸附平衡常数 解附的动态
K=Cs/Cm
2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异
ppt课件 4
吸附机理
流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流
动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分 子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之， 溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。
SO3H CH CH2 CH
SO 3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H
SO3H
SO3H
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SO3H
SO3H
50
交换反应： R-SO3-H+ + Na+ + ClR-SO3- Na+ + H+ + Cl-
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1.2 阴离子交换树脂
根据可交换的离子的不同
低交联度树脂－网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗 透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。
ppt课件 53
根据分离对象选择树脂交联度：
分离小分子物质（氨基酸） ——选择8%树脂为宜
分离分子量较大的物质（多肽）
——选择2－4%树脂为宜
保留：极性越小的组分保留越强
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3. 载体
作用：负载固定液 要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间
有较大的分子间作用力。
常用载体：硅胶 、硅藻土 、纤维素
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4. 固定液相与流动液相
18章高效液相色谱法讲解PPT课件
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四、正相化学键合色谱法
正相键合相色谱法采用极性键合相为固定相，如氨 基、氰基等。以非极性或弱极性溶剂，如烷烃加适量极 性调整剂如醇类作流动相。
正相键合相色谱法主要用于分离溶于有机溶剂的极 性至中等极性的分子型化合物。
正相键合相色谱法的分离选择性决定于键合相的种 类、流动相的强度和试样的性质。一般规律是：极性强 的组分保留因子k大，后洗出柱。流动相的极性增强，洗 脱能力增加。
第一节 高效液相色谱法的主要类型及其固定相和流动相
一、高效液相色谱法的主要类型
1、按固定相聚集状态分为：液液色谱法（LLC）和液 固色谱法(LSC)。
2、按分离机制分为：分配色谱法、吸附色谱法、离子 交换色谱法、分子排阻色谱法。
此外，按分离机制不同，还有亲和色谱法、手性色谱 法、胶束色谱法、电色谱法及生物色谱法等。
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五、反相化学键合相色谱法
反相键合相色谱法采用非极性键合相为固定相，如 十八烷基硅烷、辛基等化学键合相。流动相以水作为基 础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂，常用甲醇水、乙腈-水等
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三、高效液相色谱法的流动相
对流动相的基本要求：
①化学稳定性好；②对试样有适宜的溶解度，使k 在1-10范围内。③必须与检测器相适应；④纯度高， 粘度低。
（一）流动相对分离的影响
r==(√n /4).[(α-1)/α][k2/(1+k2)]
α受溶剂种类影响，k受溶剂配比的影响。改变溶剂 及配比，能够改变分离能力。增加流动相中强溶剂的比例， 其洗脱能力增强，使k变小。
第十八章高效液相色谱法
以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱法。高效 液相色谱法是以高压液体为流动相，采用高效固定相及高灵 敏度检测器的液相色谱法。
第十八章经典液相色谱法1
聚酰胺 聚酰胺是一类化学纤维素原料，分子中含大量 的酰胺基团，能与极性物质形成氢键，产生不同 的作用力。
除了硅胶、氧化铝、聚酰胺外，常用的 吸附剂还有硅藻土、硅酸镁、活性炭、二氧 化锰、玻璃粉、天然纤维等。
18.2.3 色谱条件的选择
按竞争吸附的原理，应同时考虑试样的结 构与性质、吸附剂的活性和流动相的极性三者 的因素。
2）吸附剂的选择 分离极性小的物质，选吸附能力强的吸附剂； 反之，分离极性强的物质，选吸附能力弱的 吸附剂。
3）流动相的选择 用“相似相溶”的原则来选 择 常见溶剂的极性由强到弱的顺序： 水>酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮> 乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯> 三氯乙烷>四氯化碳>环己烷>石油醚
流动相－水为溶剂的缓冲溶液
分离对象－离子型化合物 18.3.1 离子交换树脂 最常用的是聚苯乙烯型离子交换树脂，以 苯乙烯为单体，二乙烯苯为交联剂聚合而成。
1）阳离子交换树脂
磺酸基 SO 3H、羧基 COOH 、羟基－ OH
RSO 3 H Na Cl
交换
再生
RSO 3 Na H Cl
阴离子在强酸型阳离子交换树脂上的交 换顺序：
柠檬酸根 PO
3 4
SO HCO OH F
2 4
3
离子交换树脂对有机化合物的选择性： 阳离子交换树脂对有机碱的选择性是pKb 越小，亲和力越大。 阴离子交换树脂对有机酸的选择性是pKa 越小，亲和力越大。
1）阴离子交换树脂
季铵基 N ( CH ) 、伯铵基 NH 2、仲铵基 － NHCH
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
第十八章高效液相色谱法
第十八章 高效液相色谱法15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm ×4.6mm ，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为10.3～144.2ug/ml 的对照品溶液。
进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=1.168×105c-1.574×103，r=0.9998.精密称取黄芩颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。
平行测定供试品溶液和对照品溶液（61.8ug/ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样A A c =c 599767042507018.6110/=样c %4.17%1001255.01050%6=⨯⨯=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。
重复三次。
测得含0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。
（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。
研细后称取732.8mg （约相当于炔诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物0.0733mg/ml ）。
测得峰面积列于表18-6。
表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ）解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =⨯⨯⨯⨯==醇醇醇 试样含炔雌醇的量：)mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =⨯⨯⨯⨯⨯=⋅⋅=醇醇醇 每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608.732449.0片=⨯ 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。
经典液相色谱法
（1）基本母核相同—基能力越强
共轭双键越多，吸附能力也越强 （3）基团的空间排列—能形成分子内氢键吸附能力较弱
16
液相色谱的固定相和流动相
2. 吸附剂的选择 分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂 分离极性大的物质，选用吸附能力弱的吸附剂
常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法
经典柱色谱法 平面色谱法
现代液相色谱法
高压输液泵输送流动相
高效液相色谱法（HPLC）
4
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱
5
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱
溶质基于吸附现象而获得分离的液-固色谱分析方法 分离分析极性至弱极性的化合物
固定相——吸附剂 流动相——有机溶剂
6
液相色谱的固定相和流动相
吸附色谱的固定相 1.对吸附剂的要求 1）有较大表面积和足够的吸附能力，对不同物
质吸附能力不同 2）与洗脱剂、溶剂、样品不起化学反应，且不
溶于洗脱剂和溶剂 3）粒度细而均匀
7
液相色谱的固定相和流动相
2. 常用吸附剂 -有机类：
活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔树脂 -无机类：
亲水性凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
亲脂性凝胶 葡聚糖凝胶LH-20 聚苯乙烯凝胶
28
经典液相柱色谱法
硅胶吸附柱色谱 聚酰胺柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
平面色谱法
借用毛细作用的原理输送展开剂（流动相），色 谱过程在平面上进行的方法。 固定相成平面状态，试样溶液点于平面一端，在 相对密闭的容器中展开（分离）后，根据组分在 平面上移动的距离和浓度进行分析。 常用有薄层色谱法和纸色谱法
吸附色谱的条件选择 组分在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于： 1. 吸附剂对样品各组分的吸附能力-吸附活性 2. 洗脱剂对各组分的解吸能力-极性大小 3. 待分离各组分本身极性差异-结构性质
第十八章 高效液相色谱法 - 章节小结
一、主要内容1．基本概念（1）化学键合相：利用化学反应将有机基团键合在载体表面形成的固定相。
（2）化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。
（3）正（反）相色谱法：流动相极性小（大）于固定相极性的液相色谱法。
（4）抑制型（双柱）离子色谱法：用抑制柱消除流动相的高电导本底，以电导为检测器的离子交换色谱法。
（5）手性色谱法：利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。
（6）亲合色谱法：利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的色谱方法，是基于组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的色谱法。
（7）梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。
（8）静态流动相传质阻抗Csm：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，因而相对晚回到流路中，引起的峰展宽。
（9）键合相的含碳量：键合相碳的百分数，可通过对键合硅胶进行元素分析测定。
（10）键合相的覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
（11）封尾：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等对键合相进行钝化处理，减少残余硅醇基，即封尾。
（12）溶剂的极性参数P'：表示溶剂与三种极性物质乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子受体P'）和硝基甲烷（强偶极体）相互作用的强度。
用于度量分配色谱的溶剂强度。
P'越大，溶剂的极性越强，在正相分配色谱中的洗脱能力越强。
（13）溶剂的强度因子S：常为反相键合相色谱的溶剂洗脱能力的度量。
（14）三维光谱－色谱图：用DAD检测器检测，经过计算机处理，将每个组分的吸收光谱和试样的色谱图结合在一张三维坐标图上，即获得三维光谱-色谱图。
2．基本理论（1）速率理论在HPLC中表达式为：H=A+C m u+C s m u 用于指导实验条件的选择。
A、Cm和Csm均随固定相粒度dp变小而变小，因此保证HPLC高柱效的主要措施是使用小粒度的固定相。
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2、定性分析：比较组分与对照品Rf值。 对未知样品，要几个展开体系均有一致Rf值，才可
确认为同一物质。或双向展开法确认。
续前
（二）定量分析
1、目视比色：色斑大小，深浅。（误差大， ±10－30%）
图示
(一）分离原理：
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心， 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸 附能力差异而实现分离
（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质 吸附剂吸附能力的大小取决于
1. 吸附中心的多少 2. 吸附中心于与被吸附物形成氢键的能力大小 吸附中心↑ ，形成氢键能力↑ ，吸附能力↑
（三）吸附剂和流动相的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质 1. 被测组分性质（极性大小）：
烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸，醇 2. 吸附剂的活性：
吸附剂的活性↑，对被测组分的吸附能力↑ 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 3. 流动相的极性： 流动相极性↑，对被测组分的洗脱能力↑ “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活 性， 选择适当极性的流动相
分不开
苯+乙醇 Rf = 0.38 0.52
可分开
能否说出A、B两组分极性哪个大？
三、薄层色谱操作方法
（一）薄层板的制备
定性分析——窄条 定量分析——10×20cm
软板：吸附剂直接铺涂 硬板：吸附剂+粘合剂→糊状→铺板→凉干→活化 常用粘合剂：CMC-Na 羧甲基纤维素钠
续前
（二）点样
点样工具：毛细管或微量注射器 点样量： 一般几μl，ф2-3mm 点样位置：距底边1.5-2cm处，铅笔画线
✓ 分离机制：同液-液分配色谱
✓ 定性参数：
Rf
1
1 K VS
Vm
➢ 讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关
极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑）
非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
本章小结
1. 掌握吸附柱色谱和薄层色谱的基本原 理，固定相和流动相的选择。
2. 熟悉比移值和分离度的概念。
3．分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻） 4．特点：分析快速、灵敏、显色方便 5．应用：药物杂质检查、纯度测定
二、固定相的选择
1．硅胶
硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC 硅胶HF254或硅胶GF254——含荧光剂，254nm紫外光
照发绿光 硅胶HF365或硅胶GF365——含荧光剂，365nm紫外光
吸附薄层法
薄层色谱法 分配薄层法
分类
空间排阻薄层法
纸色谱法
薄膜色谱法
续前
一、定性参数
比移值（retardation factor， Rf） 图示
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
✓ 讨论
（1）色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层 色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为；
第十八章 经典液相色谱法
液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。
▪ 经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长
▪ 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短
18.2 液-固吸附柱色谱法
（一）分离原理 （二）常用吸附剂 （三）吸附剂和流动相的选择
常用的吸附剂有（1）硅胶； （2）氧化铝； （3）聚酰胺
硅胶（SiO2·H2O） 结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构
表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
特性：
吸水→形成水合硅醇基→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大
含水量越大，活性级越大，活性越弱，吸附能力 越小
适用：分析酸性或中性物质
2 、 洗 脱 法 ： 刮 下 ， 溶 解 ， 光 度 法 测 ±5% （基本符合微量分析误差要求）
3、薄层扫描：误差<5%(符合要求)
18.6 纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量的液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附的水
✓ 流动相：与水不互溶或水饱和的有机溶剂（饱和 正丁醇）
续前
三、分离参数
分离度： R 2(L2 L1 ) W1 W2
L1,L2色斑中心到原点的距离，w1，w2两 色斑的峰宽（扫薄测定），一般亦可用纵 向直径。
18.5 薄层色谱法
一、概述
1．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法
2．操作过程： 铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/洗脱(定量)
照发光 荧光板适用于本身不发光又无适当显色剂的物质
2．氧化铝
二、展开剂及其选择
1 .展开剂：有一种或多种溶剂按一定比例组成。 2.选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
3.常用溶剂
强极性：酸，醇类 中等极性：乙酸乙脂，氯仿 弱极性：环己烷，石油醚
续前
例：A、B两组分的试样
展开剂
A
B
苯
Rf = 0.45 0.42
固定离子 可交换离子 待测离子
注：选K择s与性离系子数的电K荷S 数[、RS[水OX3合X]m离 ]S子半径、流动相性质、 离子交换树脂性质以及温度有关 next
图示
✓ 分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离 back
18.4 平面色谱法的分类和原理
平面色谱法（plane chromatography）：是 在平面上进行分离的一种分析方法
（2）Rf与K有关，即与组分性质（极性）以及薄层板 和展开剂的性质有关；
next
图示
L0
L2 L1
返回
续前
（ 3）影响Rf的因素 ▲组分的性质：一般来讲极性↑， K↑，Rf↓
▲固定相性质：活性↑，吸附能力↑，Rf↓ ▲展开剂极性：薄层板一定，对于极性组分
展开剂极性↑，Rf↑（容易洗脱） 展开剂极性↓，Rf↓ （不容易洗脱） ▲至R前f=沿0 （未组移分行不（被被固固定定相完吸全附吸，附K，≌K0→）∞）
Rf=1 移
▲Rf范围：0< Rf <1（组分迁移速度和距离小于展开 剂迁移速度和距离）
Rf = 0.2～0.8（常用） 0.3～0.5（最佳）
二、分配系数（容量因子）与Rf的关系
1 1 K VS 1 k
R'
Vm
又
R
u u0
L L0
Rf
Rf
1 1 k
Vm Vm KVs
k
1 Rf Rf
3. 了解薄层色谱操作过程。
4. 了解纸色谱的基本原理和操作。
续前
4. 三者关系： 组分 极性
非(弱)极性
吸附剂 活性小 活性大
流动相 极性 非极性或弱极性
18.3 离子交换色谱法
固定相→离子交换树脂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分→离子型的有机物或无机物
✓ 分离机制见图示
✓ 阳离子交换树脂 交换 RSO3-H+ + X+ 再生 RSO3-X+ + H+
(三）展开
展开方式：可单向上行展开，亦可双向展开，多来自 展开等 （图示）※注意：
１．先饱和15－20分钟，再展开，防止边缘效应。 ２．展开剂浸薄层板下端0.5cm，不能浸住起始线 。 ３．层析缸应密闭。
图示
三、定性定量分析
（一）定性分析
1．显色： ①本身有色，日光下检视 ②紫外灯下显色：主要用于荧光物质有明显荧光