中国林蛙休眠期肝糖_血糖和血清蛋白含量的测定分析
中国林蛙抗菌肽分离鉴定
《吉林农业大学》2007年加入收藏获取最新中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cDNA克隆及其原核表达载体的构建霍芳【摘要】：背景与目的：抗菌肽(antibacterial peptides)又叫抗微生物肽(antimicrobial peptid es)，肽抗生素(peptide antibiotics)，是由10-50个氨基酸残基组成，常带正电荷，并具有广谱抗菌活性的小肽，是生物先天免疫系统的重要组成部分。
两栖动物皮肤裸露、潮湿，这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境。
但在长期的自然选择过程中，它们逐渐形成了防御机制，即由背部及腹部皮肤的分泌抗菌类物质来抵御有害环境因子的侵袭。
蛙类皮肤生物活性肽是抗菌肽家族的重要成员，其不但种类繁多，而且数量庞大。
通过结构与同源性分析表明这些抗菌肽属于Magainin、Bombinin、Bombinin-like、Brevinin、Esculentin、Ranatuerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin等抗菌肽家族。
两栖类抗菌肽具有高效、广谱的抗菌作用，且不易产生耐药性等特点，其这些特性激起了人们极大的兴趣，在耐抗生素病原菌株不断出现的今天，抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物。
本研究已成功克隆中国林蛙抗菌肽基因全长cDNA序列，在GenBanK中进行登录(登录号：DQ673105)，并采用生物信息学的方法对核酸序列以及氨基酸序列进行分析，进而对蛋白的结构和功能进行预测、分析，为中国林蛙抗菌肽分子生物学水平研究奠定了基础。
同时，将编码成熟抗菌肽基因序列亚克隆至原核表达载体PGEX-3X中，构建重组表达质粒进行IPTG诱导表达。
方法：(1)利用反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography RP—HPLC)和质谱(mass spectrometry)检测技术对中国林蛙皮肤分泌物中抗菌肽进行分离纯化和分析，并以革兰氏阴性菌大肠埃希氏杆菌(G~- E.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(G~+ S. aureus)为测试菌株，通过琼脂扩散法对分离出的多肽进行抑菌活性测定。
林蛙血液成分的研究
尿酸( UA)
3１8
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中华现代内科学杂志 Journal of Chinese Modern Medicine 2007 年第 4 卷 第 3 期
2１6 无机盐及酸碱测定 见表 6。
表 6 无机盐及酸碱测定 ( mmol / L)
项目
测定值
钙 ( Ca)
2１56
磷( P) 钾 ( K)
本病好发于男性, 好发年龄 40 ～60 岁; 37 例急起 发病( 88１1% ) ; 38 例( 90１5% ) 以疼痛 为主要 症状, 28 例( 66１7% ) 以 血压
增高为主要体征; 37 例有基础疾病( 88１1% ) , 主要为高血 压病( 57１2% ) , 其次为 冠心病、糖尿 病、车 祸; 心脏及 大血管 彩色
1１1 2１15
钠( Na)
131１9
氯( Cl) 二氧 化碳 结合力 ( CO2 - CP )
85１5 33１2
2１7 免疫球蛋白及补体的测定 见表 7。
表 7 免疫球蛋白及补体的测定
项目
测 定值 ( mg / 100 ml)
IgG
0
IgA
0
IgM
1１1
补体 C3
0
补体 C4
0
3 结果分析
由上述 7 个 表中 测定的 结果可 见, 林蛙 血液 中含有 糖、脂类 、蛋 白质 、核 酸、多种 酯类及 无机 盐。表 1 所 见 林 蛙 体内 含 有 丰 富的 酶 体素, 这对促进细胞内的物质代谢, 加速化学反应, 维持正常生活 起着 重要作 用。 如: ( 1) 丙氨 酸氨基 转移 酶、天 冬 氨酸 氨 基转 移 酶、 谷氨酸脱氢酶含量较多, 说明蛙体内蛋白质代谢较为旺盛, 氨基酸 脱氨 基作用 较活 跃。( 2 ) 乳酸 脱 氢 残 根、β- 羟 丁酸 脱 氢 酶 含量 较 高, 表明蛙体内糖和脂肪的分解代谢较强, 故此可促进糖和脂肪氧 化供能。( 3) 磷酸肌酸激酶含量较丰富, 说明蛙体内能量代谢较为 活跃, 磷酸肌酸的 合成分解较 快, 然而它是储 能和供能 的良好物 质。表 3 所见, 林蛙体内胆固醇和低密度脂蛋白含量较高。低密度 脂蛋白可将胆固醇运往肝外组织供给组织细胞利用。由于胆固醇 的含量较高, 因此使其代谢产物胆汁酸的含量增加。胆汁酸有促 进脂 类物质 消化 、吸 收的功 效。 表 6 所见 , 林 蛙 体内 含 有 多 种大 量 的无 机盐。 这对 维护 体 液 的 容 量 和 渗 透 压、维持 神 经 肌 肉 的 兴 奋 性、维持 体液 的酸碱 平衡起 着重 要作用 。
中国林蛙皮中胶原蛋白的提取
Preparation of collagen from the skin of Rana chensinensis
LI Lin-lin, BAO Cheng-wei, YANG Xiang-hua, WANG Zhan-yong *
(School of Environmental and Biological Engineering, Liaoning Shihua University, Fushun 113001)
中国林蛙(Rana tempoviductus ranaearia chensinensis david)简称林蛙，俗称哈士蟆，黄蛤 蟆，油哈蟆，红肚田鸡。主要产地为黑龙江、辽 宁、吉林三省，辽宁的清原、新宾、恒仁、西 丰，吉林的桦甸、舒兰、蛟河、抚松、安图、磐 石、长白、敦化，以及黑龙江的五常、尚志、宁 安等县都有分布。中国林蛙是一种是药、食兼用 的珍贵经济动物。其肉质细嫩，味道鲜美，干肉 的蛋白质含量可达79%，而从雌蛙输卵管提取出 的林蛙油(哈士蟆油)中蛋白质含量为56.3%、脂肪 含量为3.5%、矿物质含量为4.7%、无氮有机物含
*通讯作者 收稿日期：2011-07-18 作者简介：李琳琳(1988—)，女，山东济南人，硕士，研究方向为生物化工。
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提取物与应用
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2012年 第 37卷 第 2期
益，本研究初步考察了林蛙皮胶原蛋白的提取条 件，为今后进一步深度开发相应制品奠定了一定 的理论基础。 1 材料及药品 1.1 材料与药品 提取林蛙油后的林蛙干品由抚顺市东星林蛙 精品研究所提供。剥取林蛙干品的皮肤，使肉质 与皮分离，使用Na 2CO 3溶液(10%，m/v)清洗林蛙 皮，去除色素等可溶性杂质，再以清水洗涤至pH 为6.0，干燥至恒重，适度粉碎后待用[7]。 对二甲氨基苯甲醛(4-Dimethylaminobenzaldehyde)：美国Sigma公司；其余药品均为国 产分析纯。 1.2 实验仪器 A11基本型分析研磨机：德国IKA公司； ALC-1100.2电子天平：德国赛多利斯股份公司； HH-6型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司； DHG型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备 有限公司；722分光光度计：上海精密仪器仪表有 限公司；TDL-40B低速离心机：上海安亭科学仪 器厂；ALPHA 1-4冷冻干燥机：德国CRIST公司。 1.3 提取方法 准确称取预处理的干燥林蛙皮5 g，投入到50 mL的0.5 mol/L冰醋酸中，添加胃蛋白酶保温，反 应结束前加入终浓度为20 mmol/L的EDTA灭酶活。 重复提取数次，合并上清液，过滤除去杂质，蒸 馏水透析过夜后，冷冻干燥即得胶原蛋白粗品。 1.4 测定方法 取适量样品溶解于1 mL 6 mol/L盐酸中，加 入安培瓶中，封口。125 ℃水解加热4 h后，将剩 余盐酸挥发后，蒸馏水定容至100 mL。取2 mL消 解液，加NaOH调整pH至6.0，再定容至l00 mL。 得待测样品。吸取待测样品溶液1 mL，加入1 mL 柠檬酸缓冲溶液(pH 6.0)和1 mL 0.05 mol/L氯胺T溶 液。室温放置10 min后加入3.5 mol/L高氯酸溶液1 mL，室温放置10 min后加入对二甲氨基苯甲醛试 剂1 mL。65 ℃水浴保温10 min后561 nm比色测定 样品中羟脯氨酸含量。以标准羟脯氨酸溶液制备 标准曲线。 羟脯氨酸与胶原蛋白质量换算公式如下： M = C×稀释倍数×总体积/换算系数 式中：M为样品中胶原蛋白的质量； C为消解液中羟脯氨酸的质量浓度；
4种蛙皮肤活性肽的提取及生物活性比较
Comparative of biological activities of skin peptides from f our amphibians HAN J un2yo u1 ,ZHAO Rui2li1 , HAN Wen2yu1 3 ,L EI Lian2cheng1 , F EN G Xin1 ,J IAN G Li2na1 ,Q IAO
Байду номын сангаас
品市场 ;獭兔 、昆明鼠购自吉林大学实验动物中心 。 1. 2 实验用菌种 、肿瘤细胞和病毒细胞 金黄色葡 萄球菌 ( A TCC25923) 、白色念珠菌 ( A TCC10231) 、 大肠杆菌 (A TCC25922) 由本室保存 ;人结肠癌细胞 Caco22 ( TRL12TC HU8) 、乳腺癌细胞株 MCF27 、人 胃癌细胞株 S GC27901 、子宫颈癌 Hela 细胞均来源 于中国科学院昆明动物研究所 。
液于 540 nm 测吸收值 。阴性对照使用生理盐水 , 阳性对照使用 Trito n X2100 。溶血活性与 540 nm 吸收值成正比 。 1. 8 血细胞凝集活性检测 取新鲜兔血加入阿氏 液 ,按体积比 1 ∶1 轻轻混匀防止血液凝固 ,于 4 ℃ 可保存 2 周 。洗涤红细胞 ,加入 TBS2Ca2 + 缓冲液 , 1 500～2 000 r/ min 离心 5～10 min 后弃上清 。稀 释红细 胞 , 10 μL 洗 涤 好 的 红 细 胞 加 入 到 1 mL TBS2Ca2 + 缓冲液中 ,于 96 孔板中加红细胞悬液 40 ～45μL ,再加 5～10μL 溶解于生理盐水的样品 ,45 ～60 min 后观测结果 。同样方法检测对绵羊红细 胞的血细胞凝集活性 。 1. 9 抗肿瘤活性检测 利用 M T T 法[5] 检测抗菌 肽样 品 对 Caco22 ( TRL12TC HU8 ) 、MCF27 、S GC2 7901 、Hela 细胞的影响 ,测定试验样品抗肿瘤细胞 活性 。 1. 10 抗病毒活性检测 1. 10. 1 待测样品的毒性测定 按照待检样品的特 性将样品进行稀释 ,先用二甲基亚砜溶解 (5 mg 约 加 0. 2 mL ) , 然后用 1640 或 DM EM 溶液稀释至 2. 5 g/ L 。由 1 ∶10 或 1 ∶100 开始 ,在 96 孔板上作 2 倍连续稀释 ,最后每孔含样品原液 0. 1 mL 。
林蛙多糖提取方法比较与不同部位多糖含量测定
林蛙多糖提取方法比较与不同部位多糖含量测定李凤伟 刘芳芳 阎 红 张 晶(吉林农业大学中药材学院・长春・130118)摘 要:目的:对林蛙中多糖(Temporaria Chensiensis Polysaccharides,TCPS)三种常用的提取方法进行比较,并对林蛙不同部位的多糖进行含量测定。
方法:采用碱解法、酶解法、碱解酶解法提取林蛙多糖,运用苯酚-硫酸法测定林蛙多糖含量。
结果:酶解法林蛙多糖的提取率大于其它两种方法,雌蛙头部的多糖含量最高。
关键词:林蛙多糖 提取 含量测定 中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)简称林蛙,俗称田鸡、哈什蟆,属两栖纲无尾目蛙科,主产于黑龙江、辽宁、吉林三省,是我国特有的珍贵两栖药用经济动物之一,具有重要的保健功能[1]。
雌性林蛙的干燥输卵管又称哈蟆油,具有补虚、强精、退热的功效。
雌性林蛙的干燥体也能入药,有滋补强壮的作用。
中国林蛙皮肤中含有抗细菌或真菌作用的肽。
林蛙多糖具有抗凝作用,其皮肤中多糖(Hyaluronic acid,HA)能改善皮肤的保水性和弹性[2]。
林蛙多糖属于氨基多糖,氨基多糖在生物学、生理学、病理学过程中起着重要作用,具有多种药理活性,如抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤等作用[3]。
所以本试验对林蛙多糖的提取方法及含量测定进行了初步研究。
本实验采用三种不同的提取方法,提取林蛙雄头组织的多糖,并采用苯酚-硫酸比色法[4]测定含量,以肝素钠作为标准品(62.5ug/ml),对这三种提取方法进行了比较。
将优化出的提取方法用于提取林蛙不同组织中的多糖,并结合比色法测定含量。
1 实验材料及仪器1.1 实验材料与试剂林蛙:2004年10月末捕于吉林省临江地区,野生林蛙,蛙龄3年。
活蛙处死,去内脏解剖分割为头、骨、皮、卵、油、肉,90℃烘干,粉碎。
丙酮、无水乙醇、NaO H、冰醋酸、98%浓硫酸、苯酚、NaCl、NaAc、KO H购于北京化工厂,均为分析纯;肝素钠注射液(沪生物12500U P2ml);胃蛋白酶、胰蛋白酶购于上海惠世生化试剂厂。
中国林蛙皮肤生物活性肽基因的cDNA克隆、序列分析及生物活性的测定
中国林蛙皮肤生物活性肽基因的cDNA克隆、序列分析及生物活性的测定两栖类皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质,用来抵御有害环境因子的侵袭,是极具开发潜力的生物资源宝库。
中国拥有丰富的两栖类资源,在将近300个亚种中,其中三分之二是特有种,在生物活性物质开发方面具有极大的潜力。
但是,由于两栖类皮肤生物活性肽在其组织中含量少,分离获得大量的天然产物又很困难,往往不能满足进一步研究的需要。
利用分子生物学技术筛选活性肽就成为必然选择,丰富了两栖类活性物质资源库,并为进一步研究活性肽表达及分离纯化奠定基础。
本论文以辽宁省抚顺市新宾县地区的中国林蛙作为试验材料,从中国林蛙皮肤中得到一系列活性肽基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法初步分析活性肽基因的序列及结构,进而研究各活性肽的生物活性,为两栖动物活性肽的开发和利用奠定理论基础。
首先,根据GenBank中蛙类皮肤生物活性肽信号肽N-端保守序列,设计引物,采用RT-PCR和3′-RACE方法,从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了6条编码不同活性肽前体的cDNA序列,经NCBI数据库中的Blast软件,进行氨基酸序列同源性比较之后,分别命名为:preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。
序列分析结果表明,6条编码中国林蛙皮肤生物活性肽前体的cDNA序列全长为289-315bD,编码59-65个氨基酸。
其前体由3部分结构域组成:22个氨基酸残基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。
preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc属于temporin-1家族抗菌肽前体,具有肽链短,C-端酰胺化的特点;preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa属于brevinin-1家族抗菌肽前体,在肽链的C-端含有RANA盒结构,可在2个半胱氨酸残基间形成二硫键,组成7肽环;preprochensinin-1在已知多种数据库中没有发现序列同源的多肽,被鉴定为新生物活性肽。
中国林蛙皮肤活性肽研究进展
中国林蛙皮肤活性肽研究进展王慰慰【期刊名称】《新农业》【年(卷),期】2013(000)011【总页数】2页(P4-5)【作者】王慰慰【作者单位】黑龙江省抚远县畜牧局【正文语种】中文中国林蛙是极具生物学研究价值的动物，长期以来，其经济价值的开发主要集中在几种传统中药的入药利用上。
在研究过程中，人们发现中国林蛙皮肤具有损伤后不易感染、自愈速度快、修复能力强等特点。
随着分子生物学研究的深入，证实这些现象都与中国林蛙皮肤中所含有的活性肽有关，同时由于林蛙皮中含有大量的胶原蛋白和透明质酸HA，所以还有祛皱、保湿等美容功效。
林蛙皮肤中含有丰富的、功能复杂多样的生物活性物质，具有重要的应用价值及较大的开发利用潜力。
目前国内对中国林蛙皮肤活性肽研究尚处初级阶段，缺少系统和深入的研究，本文综述了当前我国中国林蛙皮肤活性肽的研究进展情况。
1.中国林蛙皮肤活性肽种类及克隆测序活性肽是指对生物机体的生命活动有裨益或具有生理作用的肽类。
现已知的两栖类皮肤活性肽有血管紧张素样肽、铃蟾肽类家族、舒缓激肽样多肽家族、雨蛙肽样多肽家族、蛙啡肽样多肽家族、Sauvagine 家族、速激样多肽家族、爪蛙肽样肽类家族等14大类。
目前从中国林蛙皮肤中提取的活性肽没有明确分类，徐义刚等应用聚丙烯酰胺电泳技术分离活性肽，获得多种蛋白多肽，主要有小分子多肽、大分子多肽和抗菌肽。
其中小分子多肽5种。
王欢等用反相高效液相色谱分离纯化得到三种多肽。
经抑菌试验分析表明，其中两种多肽具有较强的抑菌活性；并首次克隆得到两条中国林蛙抗菌肽基因cDNA序列，分别命名为CAMPs-1和CAMPs-2。
CAMPs-l基因cDNA序列全长为285bp，其中包括183bp完整的开放阅读框，推测编码61个氨基酸的多肽，分子量为7.103kDa，同时含有102bp的3’非转译区(3’UTR)；CAMPs-2基因cDNA序列全长为279bp，其中包括177bp完整的开放阅读框，推测为编码59个氨基酸的多肽，分子量为6.980kDa，同时含有102bp的3’非转译区(3’UTR)。
林蛙卵营养成分和保健功能的研究进展
食品研究与开发F ood Research And Development圆园18年6月第39卷第11期DOI ：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.11.041林蛙卵营养成分和保健功能的研究进展刘俊梅，吴世玉，王丹洋，周琪，罗泽江，于寒松*（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）摘要：林蛙卵是林蛙油生产过程中的副产物之一，因其年产量大且未能得到充分开发逐渐得到关注。
林蛙卵含有多种营养成分，具有极高的药用和保健价值。
近些年，多位专家和学者对林蛙卵的营养成分及保健功能进行了研究，重点阐述林蛙卵中多糖、不饱和脂肪酸、黑色素、蛋白质及氨基酸等营养成分，揭示其药用及保健价值，为林蛙卵的深加工提供科学依据。
关键词：林蛙卵；多糖；不饱和脂肪酸；蛋白质；黑色素；保健功能Advances in Research of the Nutritional Value and Health Function of Ovum of Rana Chensinensis LIU Jun-mei ，WU Shi-yu ，WANG Dan-yang ，ZHOU Qi ，LUO Ze-jiang ，YU Han-song *（College of Food Science and Engineering ，Jilin Agricultural University ，Changchun 130118，Jilin ，China ）Abstract ：The ovum of Rana chensinensis is one of the byproduct in the production of ovidutus ranae ，which has been more attention because of its large annual output and insufficient utilization.The ovum of Rana chensinensis is rich in polysaccharide ，polyunsaturated fatty acids ，melanin and protein in the body ，has important health function.In recent years ，the nutritional value and health function of ovum of Rana chensinensis were studied by many scholars ，and the nutritive components such as polysaccharide ，unsaturated fatty acid ，melanin ，protein and amino acid in the ovum of Rana chensinensis were described ，and its medicinal and health value were revealed ，which provided a scientific basis for the deep processing of ovum ofRana chensinensis .Key words ：ovum of Rana chensinensis ；polysaccharide ；polyunsaturated fatty acids ；protein ；melanin ；healthfunction引文格式：刘俊梅，吴世玉，王丹洋，等.林蛙卵营养成分和保健功能的研究进展[J].食品研究与开发，2018，39（11）：220-224LIU Junmei ，WU Shiyu ，WANG Danyang ，et al.Advances in Research of the Nutritional Value and Health Function of Ovum of Rana Chensinensis [J].Food Research and Development ，2018，39（11）：220-224中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David ）俗称田鸡、哈士蟆，属两栖纲、无尾目、蛙科、林蛙属，主产于我国东北地区。