CRISPRCas9基因敲除小鼠
基因编辑小鼠如何分类？
基因编辑小鼠如何分类？
基因编辑小鼠可分为三大类、7 小类：
（1）转基因（Tg）首先构建表达载体，包含启动子、增强子、编码区、polyA 等元件，然后将表达载体注入到受精卵的细胞核内，外源表达载体将插入到受精卵的基因组内，再将该受精卵移植到受体母鼠输卵管内，发育成为小鼠个体，该小鼠就会表达转入的外源基因。
（2）基因全身性敲除（KO）利用Crispr/Cas9 系统，在受精卵的目标基因的编码区两侧分别切断，然后受精卵在连接断口的过程中，会丢失掉断口之间的序列（即编码区）。
该受精卵移植到受体母鼠输卵管内，发育成为小鼠个体，该小鼠将无法表达目标基因，导致目标基因将完全失去活性，表现为全身性基因敲除。
（3）基因敲入（KI）首先构建打靶载体：包含同源臂和外源基因，然后将表达载体通过显微注射的方法注入到受精卵的细胞核内，同时利用 Crispr/Cas9 系统，在受精卵目的基因位置切断基因组 DNA，受精卵会通过同源重组将外源基因定点整合到基因组内。
该受精卵移植到受体母鼠输卵管内，发育成为小鼠个体，该小鼠就携带了转入的外源基因。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为一种强大的工具，用于在生物医学研究中精确地编辑基因组。
DUSP9基因作为一种重要的基因，其功能在多种生物学过程中起着关键作用。
因此，构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，对于研究DUSP9基因的功能及其在疾病发生发展中的作用具有重要意义。
本文旨在详细介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程。
二、材料与方法1. 材料小鼠胚胎干细胞（mESCs）、CRISPR-Cas9系统、相关基因编辑工具、培养基、生长因子等。
2. 方法（1）设计CRISPR-Cas9系统：根据DUSP9基因的序列信息，设计合适的CRISPR-Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。
（2）制备mESCs细胞：培养mESCs细胞至合适的状态，以便进行基因编辑。
（3）转染与编辑：将CRISPR-Cas9系统转染至mESCs细胞中，利用Cas9蛋白对DUSP9基因进行切割。
（4）筛选与鉴定：通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法，筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并进行鉴定。
三、实验过程1. 设计并构建CRISPR-Cas9系统，选择合适的sgRNA序列和Cas9蛋白表达载体。
2. 培养mESCs细胞至合适的状态，进行转染。
3. 观察转染后的细胞生长情况，确保Cas9蛋白的表达。
4. 利用PCR、Western blot、qRT-PCR等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞。
5. 对筛选出的细胞进行扩增培养，并保存于液氮中备用。
四、结果与讨论1. 结果（1）成功构建了CRISPR-Cas9系统，并将其转染至mESCs 细胞中。
（2）成功筛选出敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法进行了鉴定。
基于CRISPRCas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建
38基于CRISPR/Cas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建李腾雁，刘文杰，赵宏，蔡建强*（国家癌症中心/ 国家肿瘤临床医学研究中心/ 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科，北京 100021）李腾雁 博士研究生中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科目的:基于CRISPR/Cas9技术构建敲除TRPS1基因的杂合子小鼠，并进行鉴定。
方法: C57BL/6N小鼠自行交配后，使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，对可遗传的小鼠基因型进行鼠尾检测，TRPS1杂合子敲除小鼠分别与野生型小鼠交配，获得具有稳定基因型的小鼠。
结果:本实验通过使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法，所有繁殖小鼠经鼠尾基因型鉴定，证实成功构建了18只TRPS1基因敲除的杂合子小鼠。
结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除TRPS1基因的杂合子小鼠。
关键词：CRISPR/Cas9；TRPS1；结直肠癌；基因敲除小鼠摘要基金支持：国家自然科学基金(81672461) ；国家自然科学基金(81972311) ；深圳市“医疗卫生三名工程”（SZSM202011010）首都卫生发展科研专项项目(2018-1-4021)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001,2017-12M-4-002) *通信作者：蔡建强************************Generation of TRPS1 knockout mice by CRISPR/Cas9-mediated gene targetingAbstractObjectives: This study aimed to construct and identify heterozygous mice knocked out of TRPS1 gene based on CRISPR/ Cas9 technology.Methods: After self-mating of C57BL/6N mice, TRPS1 knockout mice were constructed by injecting fertilized eggs with Cas9/sgRNA, and the mouse genotypes of heritable mice were detected by tail. TRPS1 heterozygous knockout mice were mated with wild-type mice to obtain mice with stable genotypes.Results: In this experiment, the fertilized eggs were injected with cas9 / sgRNA, all breeding mice were identified by tail genotype, 18 TRPS1 knockout heterozygous mice were successfully constructed.Conclusion: In this study, we successfully constructed TRPS1 knockout heterozygous mice based on CRISPR / cas9 technology, which provided a research platform for further research on the role of TRPS1 in the occurrence, development and possible liver metastasis of colorectal cancer at the animal level.Keywords: CRISPR/Cas9; TRPS1; Colorectal cancer; Gene knockout mouseLi Tengyan, Liu Wenjie, Zhao Hong, Cai Jianqiang*(National Department of Hepatobiliary Surgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/ Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。
基因敲除型小鼠缩写
基因敲除型小鼠缩写基因敲除型小鼠（Knockout Mouse）是一种在实验室中经过基因编辑技术制造的小鼠模型。
通过敲除特定基因，科学家可以研究该基因在生物体发育、生理功能和疾病发展中的作用。
基因敲除型小鼠的出现为生命科学研究提供了重要工具，有助于我们更深入地理解基因对生命活动的影响。
在基因敲除型小鼠的制备过程中，科学家会选择目标基因，并使用基因编辑技术（如CRISPR/Cas9技术）将其敲除。
通过这种方式，小鼠的基因组中将不再包含目标基因的正常拷贝，从而使得该基因无法正常表达。
这样一来，科学家便可以观察到在缺失该基因的小鼠体内所产生的生理和行为变化。
基因敲除型小鼠的制备需要经过一系列复杂的实验操作。
首先，科学家需要设计合适的引物和合成寡核苷酸，用于引导CRISPR/Cas9系统精确剪切目标基因。
然后，利用载体将CRISPR/Cas9系统导入小鼠的受精卵中，使其在早期胚胎发育阶段就发挥作用。
经过一段时间的培养和发育，科学家便可以获得具有基因敲除突变的小鼠。
基因敲除型小鼠的制备不仅需要技术娴熟的实验操作，还需要对基因功能和细胞生物学等领域的深入理解。
科学家需要充分了解目标基因在生物体中的作用机制，以及其与其他基因的相互作用关系。
只有在对基因功能有清晰认识的基础上，才能准确选择目标基因，并制备出具有特定基因敲除突变的小鼠模型。
基因敲除型小鼠的应用范围非常广泛。
它们可以用于研究基因在发育过程中的作用，探究基因在特定组织和器官中的功能，以及揭示基因与疾病之间的关联。
通过对基因敲除型小鼠进行行为学、生理学和病理学等多方面的分析，科学家可以获取大量关于基因功能的宝贵信息。
基因敲除型小鼠是生命科学研究中的重要工具，为我们研究基因功能和疾病发展提供了有力支持。
通过制备基因敲除型小鼠模型，科学家可以更深入地了解基因的作用机制，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
基因敲除型小鼠的研究将继续推动生命科学领域的发展，为人类健康做出更大的贡献。
crispr-cas9基因敲除小鼠原理
CRISPR—CAS9基因敲除原理
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。
CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
在这一系统中,crRNA（CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。
Cas9结合gRNA，gRNA 的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA 5' 端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶DNA 上的约60个核苷酸（gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA 与Cas9结合,并由此指导与DNA 的结合.
通过gRNA上的靶点序列，在目标基因组上找到靶点序列，并揭开双螺旋，Cas9将剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。
Cas9使用简单，可满足多个靶点同时操作。
Insertion /deletion NHEJ HDR
gRNA
Cas9
Donor vector
基因敲除小鼠流程：。
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠(Cas9-KO)的制作方法-2018-2-28
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理：通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。
这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。
在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。
二、具体步骤如下：一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。
二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具（/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。
1、制备sgRNA的实验方法步骤：1）线性化pUC57-GDNA-T7载体中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。
胶回收保存备用。
2）引物退火及加磷酸将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。
3）连接&阳性菌落筛选取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。
对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。
再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用4）制备转录模板以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。
CRISPR_Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除小鼠_谷振阳
基因第三外显子碱基序列，设计针对 S1PＲ5 基因的 sgＲNA（ single guide ＲNA） ，构建 sgＲNA 表达质粒，利用 T7 ＲNA
聚合酶体外转录 sgＲNA 和 Cas9 后，将 Cas9 mＲNA 和 sgＲNA 对 C57BL /6 小鼠的受精卵进行显微注射。使用 T7E1
S1PＲ5 表达的 qPCＲ 及 Wstern blot 检测 颈椎脱臼法处死 F2 代 S1PＲ5 － / － 的 C57BL /6 小鼠 和野生型小鼠，后分别取出的脾脏，40 μm 滤网中充 分研磨脾脏，收集脾脏细胞悬液，离心后，裂解红细 胞。后收集脾脏细胞，提取总 ＲNA 和总蛋白，并逆 转录获得 cDNA，作为模板。利用引物 ＲT-S1PＲ5 － F： 5'-CTACAACTACACCGGCAAGC-3'，ＲT-S1PＲ5 － Ｒ： 5'-TAGGATGTTGGTGGCGTAGG-3'，扩增目的基 因。以 GAPDH 作为内参，比较 S1PＲ5 － / － 小鼠与野 生型小鼠中 S1PＲ5 在 mＲNA 水平的表达情况。以 S1PＲ5 的抗体（ Abcam 公司） ，actin 为内参，比较两 种小鼠中 S1PＲ5 在蛋白水平的表达情况。
基金项目： 国家自然科学基金面上项目（ 81270642） # 谷振阳和赵小利为共同第一作者． * 通讯作者： 高春记，主任医师，教授，博士生导师． E-mail： gaochunji @ hotmail． com 2015 － 09 － 01 收稿； 2015 － 11 － 11 接受
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材料和方法
质粒构建 C57BL /6 小鼠中 S1PＲ5 基因 exon3 外显子上选择 sgＲNA（ single guide ＲNA） 靶点，共设计 4 条 sgＲNA， 分 别 是 S1PＲ5 （ 1 ） － sgＲNA： 5'-ATAACCTCACTC ACCGGCGC-3'，S1PＲ5（ 2） － sgＲNA： 5'-CTACACCGGCAAGCTCCGCG-3'，S1PＲ5 （ 3 ） － sgＲNA： 5'-AAC ATGGGCGCATGGAAGCG-3'，S1PＲ5 （ 4 ） － sgＲNA： 5'-TTTGTCGGACCTGCTCGCCG-3'，然后合成含此 4 种 sgＲNA 的双 链 寡 核 苷 酸 链，连 入 经 酶 切 回 收 的 sgＲNA 表达载体，构建 sgＲNA 表达载体。测序验证 连入的片段是否正确，后选择正确的克隆，培养后提 取质粒，作为体外转录的模板。此过程由南京大学 － 南京生物医药研究院负责实施。
Cas9 TALEN CRISPR条件性敲除小鼠的原理
条件性敲除小鼠的原理
目前的条件性敲除小鼠主要是基于Cre-LoxP系统的。
Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
传统的条件性敲除
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
传统方法，首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
第二步，通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
在细胞水平上，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别 LoxP位点将抗性标记基因切除；在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
一般需要一年以上的时间，价格在15-20万不等。
华夏凯奇基于Cas9系统的条件性敲除
原理上和传统的条件性敲除类似，差别在于华夏凯奇利用Optimized Cas9/CRISPR System(OCAS)技术在基因组上加入loxp序列，可以快速获得Loxp 位点插入的小鼠。
目前我们一般只需要4-5个月。
价格也比传统方法大大降低。
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sgLkb1
Kras同源 修补
P53的基因变化
• 多为移码突变
Lkb1的基因变化
• 多为移码突变
Kras的基因变化
P53和Lkb1不断被损坏， Kras则被修补变得越发优势
最终肺中出现肿瘤
总结
• 事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中， 可以大大扩展Cas9的用途。
• 以后用此方法可以更好的对基因进行修整， 已达成更多的实验，为人类医学和生物学作 出贡献。
一、慢病毒转入树突状细胞
——转入树突状细胞实验过程
通过荧光蛋白EGFP可以鉴别 Cas9是否转导成功
设计了两个剪切位点
有转入目的基因 的小鼠大多细胞目的 基因发生移码突变， 目的基因转录和翻译 都明显下调。
二、腺病毒转入大脑皮层额叶
目标基因是NeuN
目的基因发生的改变
✓ 缺失一位 ✓ 缺失多位 ✓ 插入一位 ✓ 插入多位
CRISPR-Cas9系统的原理
sgRNA
通过设计sgRNA来确定剪切位点 设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
target
Cas9的局限性
• 受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚 胎层面的实验。
• 本实验采用Cre-dependent Rosa26 Cas9 knockin mouse克服了这个局限性。
CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling
CRISPR-Cas9系统的原理
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基 配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ） 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引 导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶 位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA， 可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点 切割。
Thanks！
荧光显示含有Cre/Cas9 的组织中NeuN表达明显减
少，而非转入非目标的 sgRNA则目标蛋白无影响
NeuN被破坏的比例十分大
Indel=insertions(插入) and deletions(删除)
多数为两个等位基因都被破坏，且其 中多为移码突变。
三、腺病毒转入肺
sgKras
sgp53
• 使得CRISPR-Cas9应用更广泛。
Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting 矢量图
Rosa26，使转 录可被诱导
荧光蛋白
转入Cas9后与野生小鼠对比
神经系统荧光对比
三种实验测试效果：
三种转接方法： 纳米粒子、腺病毒转导、 慢病毒转导。 三个系统（器官）： 免疫、神经、肺（癌）。