同源重组和基因工程
生物化学第十四章-基因重组和基因工程
第十四章基因重组和基因工程一、自然界的基因转移和重组：基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。
2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。
来源于宿主DNA的基因称为转导基因。
4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。
这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。
⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。
当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。
其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。
免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。
同源重组的原理和应用
同源重组的原理和应用原理同源重组是一种基因工程技术，旨在将不同物种或同一物种中的不同基因进行重新组合，以产生新的组合基因。
它基于DNA重组的原理，通过将两个或多个DNA片段切割并重新连接，创建具有新功能或表现的重组DNA序列。
DNA重组可以通过不同的方式进行，包括酶切和基因重配等。
其中酶切是最常用的方法，它利用特定的限制酶识别并切割DNA的特定序列，然后将切割后的DNA片段重新连接起来。
通过这种方式，可以将不同物种或同一物种中的不同基因片段进行重组，产生全新的DNA序列。
同源重组的原理基于两个主要的相似性原则：同源性和互补性。
同源性指的是两个或多个DNA片段具有相似的序列或结构，使得它们可以相互重组。
互补性则是指两个DNA片段的互补碱基序列可以通过酶的作用进行配对，从而实现重组。
应用同源重组的技术在生物科学和医学领域有着广泛的应用。
以下是一些重要的应用领域：1.基因克隆：同源重组是基因克隆的核心技术之一。
通过将目标基因与载体DNA进行同源重组，可以将目标基因插入到载体DNA中，然后将复合物转入宿主细胞中进行表达。
这种技术可以用来研究基因功能、制备基因工程药物等。
2.转基因生物：同源重组在转基因生物的制备中起着重要的作用。
通过将外源基因与宿主基因进行同源重组，可以将外源基因导入到宿主细胞中，从而使得宿主细胞表达外源基因产生新的性状或功能。
3.基因治疗：同源重组在基因治疗中也有广泛的应用。
通过将具有治疗效果的基因与载体DNA进行同源重组，可以将治疗基因导入到患者的细胞中，从而治疗一些遗传性疾病或造成器官损伤的疾病。
4.研究基因功能：同源重组可以用来研究基因的功能和调控机制。
通过将特定的基因进行删除、替换或重组，可以观察到基因功能的变化，从而揭示基因的生物学功能和相互作用。
5.创新药物研发：同源重组在新药研发中有着重要的作用。
通过对已知药物的基因进行同源重组，可以创造出具有更高效率或更低毒性的新药物。
第十四章基因重组与基因工程2
有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
第十四章基因重组与基因工程2
（三）外源基因与载体的连接
第十四章基因重组与基因工程2
1、粘性末端连接： • 同一限制酶切割位点连接 • 配伍末端连接
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
（五）重组体的筛选
1、直接选择： 抗药性标记选择
插入失活法 标志补救 分子杂交法：
原位杂交、Southern印迹
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
原 位 杂 交
第十四章基因重组与基因工程2
2、非直接选择法： 免疫学方法：如免疫化学方法 酶免检测法
指一套完整单倍体DNA（染色体DNA） 和线粒体DNA的全部序列。
第十四章基因重组与基因工程2
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目 的基因，实现其无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外 源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的 外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意 设计的载体。
组织或培养细胞 mRNA
载体
cDNA
cDNA与载体连接基因工程2
（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
载体的选择标准： • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被 感染的（供体）细胞释放出来、再次感染 另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与 受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为 转导作用。
同源重组法
同源重组法同源重组法是一种基因工程技术，它利用两个相似的DNA序列进行重组，从而获得新的DNA序列。
同源重组法可以用于制造基因突变、研究蛋白质结构和功能、制造转基因生物等方面。
下面将从原理、步骤、应用等方面详细介绍同源重组法。
一、原理同源重组法是利用两个相似但不完全相同的DNA序列进行交换来实现基因突变或转移的技术。
其原理是利用同源性使两个DNA分子在某些区域上发生配对并形成交叉点，然后通过切割和连接过程使两个分子互换部分或全部的DNA片段，从而形成新的DNA序列。
二、步骤同源重组法主要包括以下几个步骤：1.选择合适的启动子和标记基因首先需要选择一个适合的启动子和标记基因，以便在实验中检测到目标基因是否已经被成功地插入到宿主细胞中。
2.构建质粒接下来需要构建一个含有目标基因及其上下游区域的质粒。
这可以通过PCR扩增目标基因及其上下游区域，并将其与适当的质粒进行连接来实现。
3.转化宿主细胞将构建好的质粒导入宿主细胞中，使其能够表达目标基因。
4.筛选阳性克隆通过筛选阳性克隆，确定哪些宿主细胞已经成功地转化并表达了目标基因。
5.验证重组最后需要验证重组是否成功。
这可以通过PCR、Southern blotting、Western blotting等方法来实现。
三、应用同源重组法在生物学研究和工业生产中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用：1.制造基因突变同源重组法可以用于制造基因突变。
通过将一个DNA分子与另一个相似但不完全相同的DNA分子进行交换，可以在目标基因上引入点突变或插入/删除突变等。
2.研究蛋白质结构和功能同源重组法还可以用于研究蛋白质结构和功能。
通过将两个不同的蛋白质序列进行交换，可以得到新的蛋白质序列，并进一步研究其结构和功能。
3.制造转基因生物同源重组法也可以用于制造转基因生物。
通过将目标基因插入到宿主细胞的染色体中，可以实现转基因生物的制造。
四、总结同源重组法是一种非常重要的基因工程技术，其原理简单但应用广泛。
基因工程育种技术
2.大引物PCR法 （megaprimer PCR )
先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA片 段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进 行PCR扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引 物使用的DNA片段较通常的引物要大许多通常有上 百碱基，所以命名为大引物PCR法。
大引物PCR 定点诱变技术路线
6.蛋白质和酶基因诱变的策略
（1）引入二硫键提高蛋白酶的技术
（2）改变天冬酰胺提高稳定性技术
（3）提高酶活性
（4）改变酶的专一性 （5）其他基因改造技术 A、改变依赖钙离子的酶的特征 B、降低蛋白对蛋白酶的敏感性
7.基因敲除技术
（1）利用同源重组进行基因敲除
①RecA重组系统与基因敲除
②Red重组系统与基因敲除
RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻
止基因表达的目的。
RNAi技术
基因敲除技术的缺陷
随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都 已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点， 即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包 括：一方面，许多基因在功能上是冗余的,敲掉一个在功能 上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族 的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需 基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基 因进行相应的研究了。
4.Application and prospects
①建立生物模型。基因敲除技术就常常用于建立某
种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研 究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植 物或微生物个体。
②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基 因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它 对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者 是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。
基因重组,生物合成概念
基因重组基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。
发生在生物体内基因的交换或重新组合。
包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类。
是生物遗传变异的一种机制。
指整段DNA在细胞内或细胞间,甚至在不同物种之间进行交换,并能在新的位置上复制、转录和翻译。
在进化、繁殖、病毒感染、基因表达以致癌基因激活等过程中,基因重组都起重要作用。
基因重组也归类为自然突变现象。
基因工程是在试管内按人为的设计实施基因重组的技术,也称为重组DNA。
有目的的将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子,使之发生遗传变异的过程。
来自供体的目的基因被转入受体细菌后,可进行基因产物的表达,从而获得用一般方法难以获得的产品,如胰岛素、干扰素、乙型肝炎疫苗等是通过以相应基因与大肠杆菌或酵母菌的基因重组而大量生产的。
即基因重组由于基因的独立分配或连锁基因之间的交换而在后代中出现亲代所没有的基因组合。
原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。
受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。
通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。
自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。
供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触而传递大段DNA遗传信息的现象，称为接合。
细菌和放线菌均有接合现象。
高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。
基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。
基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。
1977年美国科学家首次用重组的人长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。
同源重组法
同源重组法同源重组法（homologous recombination）是一种基因工程技术，用于插入、修复或替换DNA序列。
它是通过同源基因（homologous genes）在相同或不同染色体上发生的重组事件来实现的。
同源重组法的应用广泛，包括基因敲除、基因修饰、基因治疗等。
原理同源重组法的原理基于基因在自然界中的重组现象。
在细菌和真核生物中，同源基因的存在使得基因组发生重组的可能性增加。
同源基因指的是基因序列相似度高于一定阈值的基因，可以在染色体上产生互相配对并发生重组的大片段。
同源重组法的基本步骤包括：1. 同源片段的引入：将含有所需同源片段的质粒或人工合成的DNA片段导入细胞内。
2. 同源片段与目标基因的配对：同源片段与目标基因发生互相配对，并形成交联。
3. DNA的切割和重组：通过核酸内切酶的作用，切割互相配对的DNA片段，并发生重组。
4. DNA的重修复：参与DNA切割的酶可将重组后的片段进行重复粘接，形成新的DNA链。
通过以上步骤，可以实现对基因组的精确修改。
应用同源重组法在基因工程中有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1. 基因敲除：利用同源重组法可以选择性地敲除细胞中的某个基因，以进一步研究其功能。
通过引入同源片段来替代目标基因中的部分或全部序列，从而实现基因敲除的目的。
2. 基因修饰：同源重组法可以用于对基因进行精确修饰，如点突变、插入特定序列等。
通过引入带有特定突变或目的序列的同源片段，可以在目标基因中产生相应的修饰。
3. 基因替换：同源重组法可用于基因组水平的基因替换。
通过引入带有目标基因的同源片段，可以将目标基因替换掉原有的基因，实现对基因组的全面修改。
4. 基因治疗：同源重组法被广泛应用于基因治疗领域。
通过将带有修饰后基因的载体导入患者体内，可以实现对患者基因的修复或治疗。
同源重组法的应用还包括农业、生物学研究等领域。
在农业领域，同源重组法被用于改良植物品种，提高抗病虫害能力、耐逆性等。
同源重组方法
同源重组方法同源重组是一种基因工程技术，它可以将两个或多个同源基因进行重组，从而产生新的基因组合。
同源重组方法在生物学、医学和农业等领域都有广泛的应用。
本文将从三个方面介绍同源重组方法。
一、同源重组的原理同源重组的原理是利用同源基因之间的相似性，将它们进行重组，从而产生新的基因组合。
同源基因是指在不同物种或同一物种中，具有相似序列和功能的基因。
同源基因的相似性可以通过DNA序列比对来确定。
同源重组的过程中，同源基因的相似区域会发生交换，从而产生新的基因组合。
二、同源重组的应用1. 生物学研究同源重组技术可以用于生物学研究中，例如研究基因的功能和调控机制。
通过同源重组，可以将不同物种或同一物种中的同源基因进行重组，从而产生新的基因组合。
这些新的基因组合可以用于研究基因的功能和调控机制。
2. 医学应用同源重组技术在医学领域也有广泛的应用。
例如，同源重组可以用于制备重组蛋白，用于治疗疾病。
同源重组还可以用于制备基因工程疫苗，用于预防疾病。
3. 农业应用同源重组技术在农业领域也有广泛的应用。
例如，同源重组可以用于改良作物品种，提高作物的产量和抗病性。
同源重组还可以用于制备转基因作物，使其具有更好的性状和抗性。
三、同源重组的方法同源重组有多种方法，包括基于PCR的方法、基于限制性内切酶的方法、基于质粒的方法等。
其中，基于PCR的方法是最常用的方法之一。
该方法利用PCR扩增同源基因的相似区域，然后将扩增产物进行重组。
基于PCR的方法具有操作简单、效率高等优点。
总之，同源重组技术是一种重要的基因工程技术，它在生物学、医学和农业等领域都有广泛的应用。
同源重组的原理是利用同源基因之间的相似性，将它们进行重组，从而产生新的基因组合。
同源重组的方法有多种，其中基于PCR的方法是最常用的方法之一。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，同源重组需要一系列的酶催化。
!!!是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：
片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
片段重组体：
切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。
拼接重组体：
切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。
基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) ：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。
基因工程(genetic engineering) ：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程。
工具酶功能
限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，
使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接
②缺口平移制作高比活探针
③DNA序列分析
④填补3´末端
Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5'→3'聚合、
3'→5'外切活性，而无5'→3'外切活性。
常用于cDNA第二链合成，
双链DNA 3'末端标记等
反转录酶①合成cDNA
②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶切除末端磷酸基
基因载体：
定义：能携带目的基因，具有自我复制能力，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA，噬菌体DNA，病毒DNA。
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) ：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。
重组DNA技术的基本原理和过程：
目的基因的获取(obtaining of target gene)
克隆载体的选择和构建(selecting and construction of vector)
外源基因与载体的连接(ligation of target gene and vector)
重组DNA导入宿主(introducing of recombinant DNA in host cells)
重组体的筛选(selection)
克隆基因的表达(expression of cloned gene)
转基因方法：
显微注射法；胚胎干细胞法；逆转录病毒载体法；精子载体法。
基因诊断(genetic diagnosis)：是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。
又称DNA诊断。
基因治疗(gene therapy)：是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。