人肾脏近球小管上皮细胞培养及传代

正常人肾脏近球小管上皮细胞（RPTEC）的培养方法
拆装与贮存
1.检查所有容器是否漏液或破损。

2.对于冻存细胞：将细胞冷冻管从干冰中取出并迅速放入液氮中贮存。

或者，解冻并立即
培养。

3.对于增殖细胞：用70%的乙醇或异丙醇擦洗盛有细胞的培养皿，将细胞培养皿置于培养
箱（如不特殊说明，均为37℃，5% CO2）中3到4个小时。

细胞处于平衡状态后，除去运送时的培养基并更新。

4.Bulletkit®使用说明：送达后，在无自动除霜功能的冰箱中4-8℃下冷藏保存基础培养基，
-20℃下冷冻保存SingleQuots®细胞生长因子。

如送达后已经解冻，生长因子可在4℃下冷藏，并需要在72小时之内加入基础培养基中。

加入基础培养基后，在一个月之内使用，不要再次冷冻。

5.ReagentPack TM传代试剂在运送前已经过无菌过滤在-20℃下保存。

传代试剂在运送过程
中可能会解冻。

可以进行一次再冷冻。

如果在3天之内使用，可以在4℃下冷藏。

Trypsin/EDTA溶液的保存时间有限并会在4℃下活化。

如果在送达之后出现解冻，立即分装并在-20℃下冷冻。

建议HEPES缓冲液（以下简称HEPES）和Trypsin中和液不要在4℃下冷藏超过一个月。

注意：为保持解冻后的Trypsin/EDTA的新鲜和活性，可将其按20ml分装并置于消毒的离心管中，-20℃下再次冻存。

培养基的制备
1.用乙醇或异丙醇对所有的添加剂管瓶及装有培养基的试剂瓶消毒。

2.用移液管将全部的添加剂加入培养基中。

3.用培养基冲洗添加剂管瓶。

对于每瓶添加剂，可能会有少量残存未被移取。

少量的残存，
即使10%，也不会显著影响在含有添加剂培养基中的细胞生长。

4.将添加剂管瓶上的标签撕下并贴于培养基的试剂瓶上。

以此记录每种添加剂加入的时间
和含量。

建议将全部标签贴于培养基试剂瓶上（不要将培养基的批号及有效期覆盖）以避免混淆和重复添加。

细胞解冻/起始培养
1.RPTEC(Renal Proximal Tubule Epithelial Cell，肾脏近球小管上皮细胞)的建议接种密度为
2500 cells/cm2。

2.根据接种密度和培养皿的表面积确定培养皿的个数。

在培养皿中加入适量的培养基
（0.2ml/cm2）并在培养前至少将培养皿放入培养箱中30分钟。

3.开启细胞冻存瓶前，先用乙醇或异丙醇消毒。

在无菌区内，将瓶盖旋开约1/4圈以释放
压力，然后再旋紧。

在37℃水浴中将细胞快速解冻，注意不要浸没整个冻存瓶。

仔细注意冻存瓶，当最后一片冰融化后将冻存瓶取出。

解冻超过2分钟会导致细胞功能无法达到最佳状态。

4.用移液管将冻存瓶中的细胞悬浮液分装至事先准备好的培养皿中。

轻轻摇动培养皿使细
胞均匀分布，放回培养箱。

5.不要用离心分离法移取冻存液中的细胞。

该方法比培养皿中残存DMSO对细胞造成的
损伤更大。

传代
下述操作程序均针对25cm2的培养皿。

对于其它大小的培养皿需相应改变试剂用量。

第一份培养皿的传代准备：
1.当细胞达到70-90%融合并呈现许多有丝分裂象的时候，即可进行传代。

2.对于每25cm2要进行传代的细胞：
a.解冻2ml Trypsin/EDTA至室温。

b.取7-10ml的 HEPES并达室温。

c.取4ml Trypsin中和液（TNS）并达室温。

d.取出培养基并达室温。

3.准备新的细胞传代培养皿。

4.一次进行一份培养皿的传代。

接下来所有的培养皿将按照第一份的最优化条件进行传代
（细胞数，细胞成活率，接种密度）。

在无菌区内：
1.从培养皿中抽去培养基。

2.用5ml HEPES冲洗细胞。

不要遗漏该步骤。

培养基中含有中和trypsin的多种蛋白质及钙
离子。

3.从培养皿中抽去HEPES。

4.向培养皿中加入2ml的Trypsin/EDTA。

5.在显微镜下观察细胞层。

6.将加入Trypsin的培养皿置入培养箱（胰蛋白酶消化）直到约90%的细胞驱集。

整个过程
依不同细胞种类约需要2-6分钟。

7.将培养皿在掌心轻敲使多数细胞脱壁。

如果仅有少数细胞脱壁，可能是消化的时间太短。

30秒后再次轻敲。

如果细胞仍然不脱壁，稍候并每30秒轻敲一次。

8.细胞脱壁后，用4ml Trypsin中和液中和培养皿内的trypsin。

如果多数细胞在7分钟内未
脱壁，原因是trypsin的温度不够或活性太低致使细胞无法脱壁。

按照前述的过程，向培养皿中加入新鲜的温Trypsin/EDTA进行再次消化，或者向培养皿中加入新鲜的温培养基，放回培养箱中直到准备好新鲜的胰蛋白酶消化试剂。

9.迅速将脱壁的细胞移至15ml的消毒离心管。

10.用2ml HEPES冲洗培养皿收集残留的细胞，然后加入到离心管中。

11.用显微镜观察细胞采集后的培养皿，观察残留的细胞数量。

残留量应少于5%。

12.将采集的细胞在220 x g离心5分钟。

使细胞粒化。

a. 抽去大部分上层清液，剩余100-200μl。

b. 用指尖快速轻敲管底使粒化细胞松弛。

13.用2-3ml 培养基稀释细胞，并记录稀释细胞悬浮液的体积。

14.进行细胞计数。

记录细胞收率（细胞总数）备用。

15.如果需要，向悬浮液中加入适量HEPES以达到需要的细胞密度（cells/ml）并再次计数。

16.利用下面的方程计算成活细胞的数量。

成活细胞数=细胞总数×成活百分率
17.利用下面的方程计算接种细胞的培养皿总数。

培养皿总数取决于细胞收率及接种密度。

如果在孔板上接种，建议接种密度为10000cells/cm2。

培养皿总数=成活细胞数/生长面积×接种密度
18.利用下面的方程计算单份培养皿中细胞悬浮液的体积。

单份培养皿中细胞悬浮液体积=稀释细胞悬浮液的体积/培养皿总数
19.在每个培养皿上注明传代数，细胞株数，细胞类型及日期。

20.按照0.2ml/cm2向新的培养皿中慢慢加入新鲜培养基。

21.用移液管反复抽吸细胞悬浮液确保细胞的均匀分散。

按照单份培养皿中细胞悬浮液体积
分装至事先准备好的传代培养皿中。

如果不是使用通风盖，旋松培养皿的盖。

将新的传代培养皿放入培养箱中。

换液
1.接种的转天进行换液，此后隔天进行换液。

随着细胞的融合，按照下面的标准增加培养
基的体积：融合率低于25%，培养基密度为0.2ml/cm2。

融合率在25-45%，培养基密度为0.3ml/cm2。

融合率超过45%，培养基密度为0.4ml/cm2。

2.在无菌容器中准备适量37℃的培养基。

从培养皿中抽去旧培养基，更换为新鲜的温培养
基并放回培养箱。

3.避免培养基的反复加温和冷却。

每次准备的培养基体积够单次换液使用即可。

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产品保证
体外培养的细胞寿命有限。

1.冻存后培养的RPTEC具有确保实验使用的15代群体倍增。

2.增殖后培养的RPTEC具有确保实验使用的10代群体倍增。

3.超过产品保证次数的群体倍增和传代是可能的，但会导致传代后细胞的生长率下降，生
物响应性和功能的劣化。

4.RPTEC在完全融合后会出现不可逆的接触抑制。

为避免细胞的损失，应在细胞达到80%
融合前进行传代。