细胞培养无菌操作和培养技术(2010-9-25)
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有也许恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时，细胞所有死亡。
3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
细胞培养技术
细胞培养技术摘要：细胞培养技术是成功培养细胞的前提，是分子生物学科学研究的重要手段,而细胞培养技术又是细胞试验中不可或缺的关键性技术方法。
细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术,细胞培也是研究病毒与研制疫苗的基础技术，细胞培养的培养物可为单个细胞或细胞群，但细胞培养工作十分繁琐，且环节较多。
关键词：细胞；培养；问题的提出：细胞培养技术是研究细胞的技术方法,指的是从体内取出単个细胞或细胞群摹拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一定营养条件下,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
被培养的细胞是科学研究的重要对象。
近年来分子生物学,分子遗传学获得巨大进展,动物和人的培养细胞被广泛应用于该领域的研究,成为一个有力的手段。
细胞培养到底有哪些培养技术用于实践？又有哪些培养方式正在被运用？现阶段细胞培养技术又有哪些问题呢？问题的讨论：细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境, 在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下, 使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术. 从体内取出细胞首次培养即为原代培养 ( P r i ma r yCu l t u r e ) , 这是细胞培养的最初和必经阶段. 当原代培养细胞生长到一定时期, 受到群体环境限制, 就需要转移到另一容器才能继续生长, 称为传代或继代培养(S u b c u l t u r e ) . 根据原代培物性状的一致性与否, 传代成功后称为细胞系 (Ce l ll i n e ) 或细胞株 ( Ce l lS t r a i n ) . 这些细胞一般可顺利传 40～ 50代次, 并保持染色体二倍体数量和接触抑制, 传至50代左右时则出现生长停滞, 大部分衰老死亡。
此类称为为有限细胞系 /株; 在细胞传代的过程中, 有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系 /株.当细胞生长至高密度时,即需分殖至新的培养瓶中,否则就会影响细胞的生长,甚而引起死亡。
(整理)食品生物技术
一、名词解释1.生物技术：利用生物体系，应用先进的生物学技和工程技术，加工或不加工底物原料，以提供所需的各种产品或达到某种目的的一门新型跨学科技术。
2.食品生物技术：食品生物技术是生物技术在食品生产原料、加工和制造中应用的一个学科。
3.基因工程：基因工程是对DNA大分子上的遗传单元（基因）进行体外操作，把不同来源的基因按照单元设计的蓝图，重新构成新的基因组合（即重组体），再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物技术。
4.PCR技术：聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称基因的体外扩增法。
5.载体：基因克隆载体是指用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA。
6.基因组文库：指由来自染色体DNA的全部DNA片段组成的基因文库。
7.转基因食品：利用基因工程技术对食品资源的改造主要涉及到对植物性资源和动物性资源的改造，通过对被加工材料的处理，生产出符合人类需要的基因工程食品。
8.细胞工程：在细胞水平上研究开发、利用各类细胞的工程，是人们利用现代分子生物学和现代细胞分子学的研究成果，根据人们的需求设计改变细胞的遗传基础，通过细胞培养、细胞融合等技术大量培养细胞乃至完整生物个体的技术。
9.细胞周期：正常分裂的细胞从前一次分裂结束到下一次分裂完成所经历连续动态过程。
10.细胞融合：两种不同亲株的细胞经酶法除去细胞壁后，得到两个球状原生质体置于高渗溶液中，采用生物法、化学法或电处理法，促使两者互相凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，获得新的细胞。
11.酶工程：利用酶催化作用，在一定的生物反应器中，将相应原料转化成所需要产品的过程，它是酶学理论、基因工程、蛋白质工程与发酵工程相结合而形成的一门新技术。
12.发酵工程：是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，由于它的主体是微生物，又称为微生物工程。
13.发酵食品：是一类通过发酵手段生产出来的一类产品，或在该产品的某一阶段采用了发酵手段。
细胞层流培养室
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无菌条件
层流净化细胞培养室管理规则
我院层流净化细胞培养室设计标准为万级，专供 细胞培养、冻存以及细胞治疗用。层流净化细胞培养 室的总体要求：经济、有序、高效、安全。初步制定 相关制度如下：
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无菌条件
1、准入制度： 1）必须取得实验室相关实验技能考试合格方可进入层流净化室； 2）在本室工作的实验人员应严格遵守本室工作守则，外来人员在 进入净化室工作之前，必须接受培训； 3）没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作； 4）进入净化室后要保持安静，不得大声喧哗。
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无菌条件
洁净层流罩:
技术性能参数： (1)净化等级：100级(美国联邦标准209E) (2)平均风速：0.25～0.45m/s(可调) (3)噪音：≤62dB(A) (4)电源：220V/50HZ 层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化设备。它主要由箱体、风机。初效空气过滤器、 高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成，外壳为不锈钢或彩钢板。该产品既可悬挂，又可地面 支撑，结构紧凑，使用方便。可以单个使用，也可多个联接组成带状洁净区域，形成洁净隧道。 洁净层流罩是将空气经风机以一定的风压通过高效空气过滤器后，由阻尼层均压，使洁净 空气呈垂直层流型气流送入工作区，从而保证了工作区内达到工艺所需的高洁净度。
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无菌条件
4、出入制度： 总体原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打 开下一个门，出入线路绝对不能逆行，使缓冲间起到应有的作用。 1）层流净化细胞培养室共有两个缓冲间，进入每个缓冲间必须更换指定消毒的 拖鞋； 2）穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行离开层流净化室； 3）人流：打开细胞培养室外门，进入第一缓冲间，开灯，关闭细胞培养室外门, 穿戴专用的洁净隔离衣、工作鞋帽、口罩等；打开第一缓冲间内侧门，进入第二缓冲 间，新洁尔灭泡手1分钟，烘干，关闭第二缓冲间外侧门；打开第二缓冲间内侧门， 进入层流净化细胞培养室, 关闭层流净化细胞培养室外门。 4）物流：所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行；物品进入 层流净化细胞培养室时，应先打开传递窗外侧门，将物品放入传递窗，关闭传递窗外 侧门，打开紫外灯照射１５分钟；人员进入层流净化细胞培养室后，关闭紫外灯，打 开传递窗内侧门，取出物品；物品出室次序与以上进室次序相反，但不需紫外线照射。
第四章 组织细胞培养技术
微生物的清除常见的几种方法：
1．抗菌素除菌法
由于各种抗菌素的性质不同，联合应用比 单用效果要好；但在污染出现后应用抗菌 素效果往往不理想，预防性应用比污染后 应用更好。
2．加温除菌法
该法主要针对支原体，因为支原体耐热性 较差。
3、动物体内接种除菌法
把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动 物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支 原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长， 待一定时间后，从动物体内取出细胞再培 养。
第4章 细胞培养技术
体外培养是指从活体内取出细胞、 组织，置于体外摹拟体内生长环境(包括 生理、营养、温度及无菌)下，使其生存 和生长并维持其结构和功能的方法及过 程，包括细胞培养、组织培养及器官培 养3个方面的技术。
主要设备和设施
组织细胞培养实验室是进行组织细胞培 养的场所，有别于一般的实验室。要求环境 及条件能够保证不受微生物和其他有害因子 的影响，营造一个有利于细胞生长的人工环 境。
组织细胞培养中所用器具的清洗至关重 要，直接影响组织细胞培养。
新购置的器械和器皿，使用前必须经过 彻底的清洗；用过的器械，要立即浸泡、 清洗及干燥，在灭菌前状态下保存。
所有清洗过程均在清洗间进行，初洗间 进行自来水、洗涤剂、碱水、硫酸清洁液 等的清洗和浸泡步骤；清洗间进行蒸馏水 冲洗、干燥、干烤、高压蒸汽消毒等步骤。
内眼可见，有的散在分布。
（二）细菌污染
细菌污染后的培养液大多变浑浊，有的 对培养液无明显影响。
（三）支原体污染
支原体是细胞培养中最常见且不易发现 的一种污染，是一种介于细菌和病毒之 间的能独立生活的最小微生物。
二、微生物污染的排除
细胞受污染后一般较难排除，因此，应从 预防着手。
无菌技术操作手册
无菌技术操作手册
前言
无菌技术是微生物学和生物制药学中的基础技术之一。
本操作
手册旨在向初学者介绍无菌技术的基本概念和操作方法，确保实验
室操作过程中的无菌环境，保证实验室实验的准确性和可靠性。
实验室准备
在进行无菌实验前，必须将实验室清洁卫生。
实验室清理包括
擦拭工作台面，清洗培养皿和培养管等实验器具。
在实验开始前，
必须进行消毒操作，包括工作台面、培养皿和培养管。
无菌技术操作步骤
第一步：穿戴实验室衣物
在进行任何实验工作之前，穿着适当的实验室衣服（包括实验服、实验鞋、手套等）。
务必将实验室衣物彻底清洗、烘干、消毒。
第二步：准备工作台
使用70%乙醇或1%双氧水进行消毒，擦拭实验台面时，应先从边缘开始，由外向内反复擦拭，这样可以保证台面的整体清洁。
第三步：准备培养皿和培养管
用消毒棉球沾取75%酒精，擦拭培养皿和培养管表面，在灯火下进行操作。
第四步：接种
将消毒过的工具取出，接种细菌。
第五步：封闭培养皿和培养管
将培养皿和培养管紧密地密封，防止细菌外来污染，放入培养箱或恒温培养箱中培养。
实验室注意事项
1. 实验器材必须在灯下进行操作，防止外界细菌的干扰。
2. 实验室内必须保持高度清洁，切勿将实验物品随意放置。
3. 实验过程中尽可能不将手伸入操作台内，若必须进行操作则需要在已清洗并消毒过的条件下操作。
以上为无菌技术操作手册的简要介绍，仅供参考。
在无菌实验的操作过程中，操作规范和操作规程必须严格遵守，以保证实验结果的准确性和可靠性。
无菌实验室操作规程
无菌实验室操作规程一、引言无菌实验室是用于进行生物实验和微生物培养的特殊实验室。
为了保持实验环境的无菌性，必须严格遵守操作规程。
本文档旨在规范无菌实验室的操作流程，以确保实验结果的可靠性和实验人员的安全。
二、实验室设备与准备1. 实验室应处于封闭、无尘、无菌的环境中。
实验室内应配备必要的设备，如无菌操作台、高压灭菌器、培养箱等，并保持其正常运转。
2. 实验室操作台、仪器仪表、培养物应在实验前进行消毒和灭菌处理。
消毒剂的选择应符合实验要求，并按照使用说明正确使用。
3. 实验前必须戴好手套、外科口罩和实验室服装。
实验室服装应定期更换并定期进行消毒。
三、操作流程1. 无菌操作台的使用（1）准备工作：将所需培养物、培养皿、试管等放置在无菌操作台上，确保其表面干净且无灰尘。
（2）操作前消毒：用70%乙醇或其他消毒剂擦拭操作台面和手套表面，确保无菌操作台的表面无菌。
（3）操作过程：将手套的手指轻轻插入培养物内，取出适量培养物，尽量不接触培养物的表面，避免污染。
（4）操作后处理：将使用过的培养皿、试管等放入高压灭菌器中进行灭菌处理。
2. 培养箱的使用（1）准备工作：将培养箱预先打开并调整到所需的温度，将培养物放置在培养箱内。
（2）操作前消毒：用70%乙醇或其他消毒剂擦拭培养箱表面，确保表面无菌。
（3）操作过程：打开培养箱门时，应迅速将所需培养物放入箱内，避免持续较长时间开启培养箱门，以免造成环境污染。
（4）操作后处理：关闭培养箱门，将使用过的培养皿等放入高压灭菌器中进行灭菌处理。
四、实验室清洁与检查1. 实验室的定期清洁：实验室应定期进行清洁，包括实验台面、仪器仪表、培养箱等设备的清洁和消毒。
2. 废弃物处理：应将使用过的培养皿、试管等放入高压灭菌器中进行灭菌处理，确保废弃物的无菌性。
3. 实验室的无菌检查：定期对实验室进行无菌检查，检测空气中的微生物数量和无菌操作台等设备的无菌状况，如发现问题应及时进行处理。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
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细胞污染的种类
细菌污染 真菌污染 细菌和真菌的清除 支原体污染 支原体的清除
细菌污染
细胞培养常见的污染 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假 单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变 圆脱落死亡。
• 因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般 需添加10%～20%的血清，
血清的种类
• 何谓FBS, FCS, CS, HS ? • FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎 牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要 再使用。 • CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
• 使用前需打开无菌工作台及净化室的紫外 灯，消毒半小时以上。 • 进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台 风机，等待30 min 以上，以排尽臭氧。 • 穿好隔离衣，戴好口罩，帽子，换鞋。 • 风淋 1- 2 min。 • 75 %酒精擦手。
• 点燃酒精灯，注意酒精液面；超净台内应 避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管， 试管，培养瓶等均事先灭菌。 • 打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打 开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应 经火焰烧灼。 • 水平式风机的超净台，应使瓶口斜置，应 尽量避免瓶口敞开直立。
第二部分 细胞培养技术
林 红 9-25-2010
一 细胞培养无菌操作
• • • • •
常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂
常用仪器设备
• • • • • • 超净台或生物安全柜：细胞操作 CO2 培养箱：细胞培养 液氮罐：细胞长期冻存 37℃ 水浴：培养溶液预热，细胞复苏 倒置显微镜：观察细胞 离心机：收集细胞，细胞常用300g转速 5min • 冰箱：细胞培养溶液分装储存 • 负压吸引器：细胞培养废液吸取
支原体污染
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 不能以 肉眼观察出异状。 除极有经验之专家外，大多数 遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，
代谢及研究之任一数据。
支原体污染
危害： 世界性问题，平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部 分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变 化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 来源： •操作环境不良 •操作人员的疏失 •实验器具不洁等 •已受污染的细胞 •已受污染的培养基、血清
细胞消化液
分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单 trypsin 独或混合使用 胰蛋白酶溶液 • 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 • 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化 作用 EDTA· 4Na 溶液 • 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小， 价格低廉，使用方便 • 常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因 残留的EDTA 会影响细胞生长
血清使用注意事项
1. 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如 果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中， 由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否 则易发生污染或容器冻裂之情形。
血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至 室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气 泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至 37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 热灭活（heat-inactivation）是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之 血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。 除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多， 且会影响血清之品质。 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时 血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质
球菌污染
真菌污染
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养 耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
细菌和真菌的清除
使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。 联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素（青霉 素和链霉素，简称P/S）。 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗法，于 加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早 期有效。
谷氨酰胺
• 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加， 由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分 解约50%，所以都是在使用前添加 • 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加 入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培 养液内 • 使用终浓度为1-4mM • 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L） • 配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM 的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分装小瓶， -20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩 液，终浓度为1-4mM
超净工作台
超净台或生
超净工作台（超净台，clean bench）
是为了保护试验品或产品而设计的，通过吹 过工作区域的垂直或水平层流空气防止试验 品或产品受到工作区域外粉尘或细菌的污染。
生物安全柜（Biological safety cabinets，BSCs）是
为操作原代培养物、菌毒株以及 诊断性标本等具有感染性的实验 材料时，用来保护工作人员、实 验室环境以及实验品，使其避免 暴露于上述操作过程中可能产生 的感染性气溶胶和溅出物而设计 的。
实验前准备
• 预热实验用相关试剂（培养基、PBS、D-Hanks 液、实验用水） • 预融实验用液体（血清、胰酶、双抗、实验添加 剂） • 检查离心机、水浴箱、显微镜、超净台、培养箱 是否处在正常状态 • 用75%酒精涂手，清洁操作台 • 检查超净台内各种实验器材（离心管、滴管、移 液器、酒精灯、镊子、记号笔、培养瓶等）
2.
3.
4.
血清沉淀物
• 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白 (lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成， 这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀 物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培 养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会 阻塞过滤膜。 • 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形 成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常 会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“， 但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖， 但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应 不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换 另一批号的血清。
血清
• 血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质 主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质 的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为 必需氨基酸），必须由培养液提供。 • 血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生 长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）； • 血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他 活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。 • 动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。
细胞冻存液
• 保护剂：甘油或二甲基亚砜 （DMSO） • 能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷 冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细 胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成 造成的细胞损伤。 • 配制：20%血清培养基+10% DMSO（或甘 油）
细胞污染
• 主要的污染原因为无菌操作技术不当、 操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞 等。 • 一旦发现细胞污染，应直接灭菌后丢弃之。 • 严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质 良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之 最好方法。
酚红
• 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 –红色表示中性pH –黄色代表酸性pH –紫色表示碱性pH –培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢 出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示 剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗 红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。 若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。 • 在一些特殊培养液中不含酚红 –因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其 是雌激素）样作用
移液管和移液器
• 漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。
同一根吸管或滴管不应连 续用于几个不同的细胞系； 吸取培养基的吸管应离开 培养瓶或试管口0.5cm， 避免伸入培养瓶口或试管 口；以防止细胞系的互相 混杂污染。
细胞培养箱
工作原理 • 通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/ 组织在生物体内的生长环境如恒定的酸碱度 （pH值：7.2-7.4）、稳定的温度（37°C）、 较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平 （5%），来对细胞/组织进行体外培养的一 种装置。
细胞培养基
• 干粉培养基和液体培养基
– 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌， 其优点是价格便宜。缺点是配制过程 繁琐，质量不易控制 – 液体培养基是由专业厂家按标准规模 化生产，不仅质量得到保证，而且使 用十分方便