细胞培养的操作步骤
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。
同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。
（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。
3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。
4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。
5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。
6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。
传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。
3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。
4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。
消化程度是细胞不能滑落，要吹落。
500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。
5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。
8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。
9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。
80微升，100微升都可以。
冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。
9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。
细胞培养过程
细胞培养过程：复苏、换液、传代、冻存1、复苏（1）取适量培养液加入离心管中；（2）将冻存的细胞在37℃水浴中快速使其融化；（3）将细胞吸入离心管中，1000r.min-1离心5 min,倒去上清液，规定加入培养液，打匀，转移到培养瓶中，即可。
2、换液（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉，余液用棉花蘸掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（从没有细胞的一侧倒掉）（3）加入新鲜培养液，即可。
3、传代（细胞生长得较满、较好，分瓶后至少培养两天后再铺板）（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入2 mL胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶，加入培养液，打匀后，分至多个瓶中。
4、冻存（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶（可不倒），加入适量培养液，将贴壁细胞吹落，吸入到离心管中，1000r.min-1×5min,倒掉上清液，加入900uL新生牛血清（营养来源）和100 uLDMSO（保护剂）打匀后，吸到冻存管中，密封，于-80℃冻存。
1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存预冷；2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，PBS 冲洗两次，用胰酶消化细胞（尽可能温和）；3.再次用完全培养液悬浮细胞，将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀。
4.在每支冻存管中加入1ml细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存日期。
5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力，如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐）最好；或者可以在4℃，2h；然后转到-20℃，2h；-80℃，2h；放入液氮罐。
细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
【1】细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是生物学实验中常见的一项重要技术，它广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。
通过细胞培养，科研人员能够研究细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程，同时也可以进行药物筛选、生物学效应观察等实验。
然而，细胞培养是一项复杂的工作，需要严格遵循一系列步骤和要求，并且需谨慎对待各项注意事项。
在本文中，我将以从浅入深的方式，全面探讨细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项，帮助你更深入地理解这一技术。
【2】细胞培养的具体步骤和要求让我们来了解细胞培养的具体步骤。
通常情况下，细胞培养的主要步骤包括：细胞分离、细胞计数、细胞传代、培养基准备、细胞接种、培养条件控制等。
具体来说，细胞培养的步骤包括收获细胞、细胞解聚、细胞计数、调整细胞密度、接种细胞、培养细胞、处理细胞等。
在进行这些步骤时，需要保持实验操作台面清洁整洁，常备所需培养工具、培养耗材和培养试剂，并且要准确记录实验过程中的重要参数和数据。
细胞培养的要求也是至关重要的。
要选择合适的细胞系，确保来源纯净、鉴定正确、培养活力好。
培养基的选用也十分重要，要根据不同细胞类型的需求来选择适当的培养基，并添加必要的生长因子、氨基酸、维生素等。
培养条件的控制也十分重要，包括温度、湿度、二氧化碳浓度、通风情况等。
细胞培养的灭菌和无菌操作更是必不可少，细胞培养过程中的任何污染都可能对实验结果产生影响。
【3】细胞培养的注意事项在进行细胞培养时，需要特别注意一些细节和注意事项。
要保持室内整洁，操作台面、培养箱、生物安全柜等工作台要保持干净，并且要经常消毒。
要做好个人防护工作，戴口罩、手套、工作服等，避免人体细胞对培养的影响。
要定期检查培养箱、生物安全柜等设备的运行情况，确保培养环境的稳定性和安全性。
对细胞的培养时间、传代次数、细胞密度等也需要严格控制，不可随意增加培养时间或传代次数，以免细胞出现突变或异常。
【4】对细胞培养的个人观点和理解从事细胞培养工作多年，我深知细胞培养的重要性和复杂性。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养详细过程及注意事项
细胞培养详细过程及注意事项细胞培养是在体外培养和维持生物细胞生长和繁殖的一种技术，它是生物学、医学研究和药物研发等领域的重要实验手段。
细胞培养的过程需要遵循一定的步骤和注意事项，以确保细胞的正常生长和繁殖。
细胞培养的详细过程如下：2.细胞分离：将组织或细胞样品分离，去除多余的组织或细胞，获得单个细胞的悬浮液。
分离的方法包括酶消化、机械或化学分离等。
3.细胞培养基准备：准备培养基，培养基的配制根据细胞的要求而定，可以是无血清培养基、低血清培养基或含血清的培养基。
培养基提供了细胞所需要的营养物质和生长因子。
4.细胞接种：将细胞悬浮液接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中，密度通常在1×105至1×106个细胞/mL之间。
接种后，培养皿或培养瓶需放入培养箱中，设定适当的温度、湿度和气体环境。
5.细胞培养条件控制：细胞的生长和繁殖需要适宜的培养条件。
常规的培养条件包括37℃、5%CO2和95%湿度。
通过调节培养基的pH值、温度和培养箱内的CO2和湿度等参数，来维持良好的培养环境。
6.细胞观察和培养基更换：培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态和形态，通过显微镜观察细胞的形态变化和细胞层的覆盖率等指标。
根据需要，定期更换培养基，以确保提供足够的营养物质和维持适宜的细胞密度。
7.细胞传代：当细胞达到充分生长的状态时，需要进行传代，即将细胞从当前培养皿或培养瓶中移至新的培养皿或培养瓶中，以保证细胞的健康和生长。
用一句话总结上述细胞培养的过程就是从细胞分离到细胞培养，并按照一定条件进行观察和传代。
在进行细胞培养时，需要注意以下事项：1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细胞被异物或外源性微生物污染。
操作前，材料和设备需要进行消毒。
2.培养基筛选：根据细胞的特性和需求选择合适的培养基，确保细胞能够获得必要的营养物质和生长因子。
3.冻存细胞库：定期将细胞进行冻存，以备后续使用，以避免病毒污染或细胞失活。
细胞培养操作流程
细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。
它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。
下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。
2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。
可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。
分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。
3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。
根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。
4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。
确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。
5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。
传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。
将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。
6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。
根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。
7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。
选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。
8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。
例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。
收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。
9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。
细胞培养的过程及注意事项
3 6 细胞培养的过程及注意事项细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；（1）基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。
原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。
1、组织块培养法（1）基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。
再用平衡液（PBS）或Hanks 液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。
2、注意事项1）、组织块接种后的前3 天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。
要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
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传代细胞培养的视频拍摄脚本一、实验准备器材液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、离心管（9个）、带塞培养瓶（不定个）、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶（一）、器皿1玻璃器皿的清洗灭菌：种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。
以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的）（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。
刷洗后经行烘干（镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法）（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。
将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。
清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间）（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
（镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间）（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。
包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
（镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌）（实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）2、橡胶制品清洗消毒种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用（镜头：0.5mol/L NaOH煮沸，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟各一个镜头，因为在上面已经示范过干燥箱和灭菌锅的操作方法，在使用干燥箱和高压灭菌时只需以字幕的形式显示烘干温度、灭菌温度、灭菌时间即可）3、塑料制品的清洗消毒种类：瓶盖、离心管塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
（因在器皿的准备过程中玻璃制品是最主要的，故塑料制品的清洗和消毒灭菌的方法可用字幕的方法显示出来）（注意：各种不同材质器具的不同灭菌时间？温度设置？）2、试剂准备试剂：RPMI l640培养液, 小牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。
重点配置的药品：RPMI l640培养液、0.2%胰蛋白酶液(typsin)。
药品：RPMI l640 培养粉、双蒸水、HEPES、碳酸氢钠、青霉素、链霉素；typsin粉末。
(HEPES氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围, 细胞培养常用10mmol/L。
10mmol/L HEPES缓冲液配制方法如下：准确称取HEPES 2.383g，加入新鲜三蒸水定容至1L。
过滤除菌，分装后4℃保存。
)器材：大三角瓶、移液枪及枪头、无菌EP管、无菌室、无菌操作台、磁力搅拌器、G6型号细菌过滤漏斗、细菌过滤漏斗、冰箱。
（1）R PMI l640基础培养液的配制：称取RPMI l640 培养粉 10.4g溶于1,000 mL双蒸水中,磁力搅拌器搅拌40min. 加HEPES 2、4g。
搅拌十分钟，2g碳酸氢钠搅拌十分钟。
过滤前要加双抗加入双抗至最终浓度为 100单位/mL。
过滤经G6型号细菌过滤漏斗抽滤后备用1、取RPMI l640培养粉10.4g，加入1L双蒸水于磁力搅拌器下搅拌40min2、加入HEPES 2、4g，再次搅拌溶解10min，再加入2g碳酸氢钠，搅拌十分钟（每一步一个镜头一个配音说明即可，每一步骤6s左右时间）3、无菌实验室打开紫外灯，紫外灭菌30min（可配音说明，6s左右）4、人工消毒准备，无菌操作台酒精擦拭灭菌（镜头：实验人员穿上无菌实验室操作服用戴上橡胶手套，然后就位用酒精棉球消毒试验台）5、将灭过菌的细菌过滤器进行组装（镜头：细菌过滤器的灭菌时间和灭菌温度可以配音或字幕的形式显示）6、在无菌工作台上在培养基中加入双抗，并混匀，配成各100单位/ml双抗，混合后经行细菌过滤器过滤，并示范操作7、将灭过菌的小玻璃瓶于试验台上解封，取下封口纸，将小玻璃瓶瓶口于酒精灯上过火，分装培养基，装好后再次过火，用过火后的橡胶塞塞紧，并编号，写上配置时间和配置人（每瓶90ml，只示范一个即可）8、将封装好的培养液放入4℃冰箱中存放备用。
（在这几个步骤中每一步均以10s左右的视频时间演示，再加上培养，然后切入下一个步骤）（2）胰酶的配制：称取适量typsin粉末配制成0.1%--0.25%的浓度（0.006gtypsin粉末+3ml 双蒸水），配制时要使用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如D-hank's溶液），因为这些物质都会对胰酶产生抑制作用，胰酶无菌过滤时胰酶量多不锈钢过滤，量少时用抽提过滤。
二、实验台准备，实验人员就位消毒剂:操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用碘酒、酒精消毒。
无菌室内桌椅和物体的消毒可用过氧乙酸、来苏儿等擦拭或浸泡。
紫外线：主要用于消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。
进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。
紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。
（镜头：在紫外线灯照射下的超净工作台和实验室一个镜头）三、复苏细胞原理：冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。
在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。
在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。
解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。
材料：冻存的Hela细胞器材：带塞培养瓶、离心管（3只）、胶头滴管（3只）、1ml移液枪、1ml移液枪头、烧杯、酒精灯、试管架、离心机、无菌操作台、恒温培养箱药品：RPMI l640培养液、小牛血清、酒精镜头一：细胞解冻与活化（每一步为一个镜头）实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液。
（2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。
（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中。
（4）低速离心(1200r／min) 6min，去上清后再用5--9ml培养液再清洗离心一次。
镜头二：装瓶培养（1）离心后去掉上清液，在离心管中滴加内滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀。
（2）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴小牛血清（是小牛血清为10%的浓度），盖上瓶盖，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。
四、传代培养及其操作步骤原理：细胞在体外培养时，为使其生长状况与其在体内生长状况相似，必须在体外模拟体内生长的环境条件。
一是提供细胞存活的必须条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其他相关的生长因子，还需要氧气、适宜的温度、适宜的酸碱度、适宜的渗透压，动物细胞还要加入适宜的血清。
当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。
传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。
材料：培养瓶中处于对数期的Hela细胞器材：带塞培养瓶2—3个、离心管（3只）、胶头滴管（3只）、弯头滴管、1ml移液枪、1ml移液枪头、烧杯、酒精灯、试管架、离心机、无菌操作台、恒温培养箱、倒置显微镜药品：RPMI l640培养液、0.2%胰蛋白酶液、小牛血清、酒精镜头一：制细胞悬液（1）试验台的消毒工作准备好，尽量吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。
（此处消毒同上，消毒步骤可省略不拍，以配音的方式说明在实验前已进行试验台的消毒，关于细胞培养的换液再次可以做一个说明示范）（2）向瓶内加入胰蛋白酶液1ml，置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。
（4）吸出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量，轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再少量含血清的加培养液（要加多少？）。
（5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。
（6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1200r／min) 6min注意事项：掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不易从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。
若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液5--9ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。