细胞培养中无菌操作技术
细胞培养—无菌操作课件
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洁净级别—无菌药品生产所需的洁净 区可分为4个级别
• A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接 触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单 向流操作台（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域 必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明 单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使 用较低的风速。
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无菌操作—器皿的消毒
• 所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭 菌烘干后才能放入超净台内
• 已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以 表面经75%酒精擦拭后直接放入超净台
• 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的 瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
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生物安全柜
• 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域 是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到 室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为， 50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎没 有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影响 室内的气流平衡。
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洗手和着装
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洗手和着装
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无菌操作—个人防护
• 在实验室工作时必须使用个体防护装备 • 个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内 • 实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋
细胞无菌检查标准操作规程
细胞无菌检查标准操作规程标准操作规程：细胞无菌检查1. 引言细胞无菌检查是实验室进行细胞培养和实验的关键步骤。
细胞环境的无菌性是保证实验结果准确性和细胞生长的重要因素。
本标准操作规程旨在规范细胞无菌检查的操作，以确保实验结果的可靠性。
2. 器材准备2.1 离心机：用于离心培养物，以分离细胞和培养液。
2.2 高温消毒器：用于消毒培养器具和试剂。
2.3 紫外线灯：用于消毒培养箱和操作台面。
2.4 细胞培养箱：用于细胞培养的环境，保持恒定的温度和湿度。
2.5 无菌离心管和移液器：用于处理无菌液体和细胞移植。
2.6 片玻片和培养皿：用于制备细胞标本。
2.7 无菌培养物：用于细胞培养和细胞无菌检查。
2.8 无菌培养基：用于培养细胞。
2.9 无菌生理盐水：用于洗涤细胞。
3. 操作步骤3.1 消毒操作台面和培养箱：使用紫外线灯对操作台面和培养箱进行紫外线照射消毒，确保无菌环境。
3.2 滴漏法消毒培养器具和试剂：将培养器具和试剂放入高温消毒器中，设置合适的温度和时间进行高温消毒。
3.3 细胞无菌接种：将需要无菌检查的细胞接种到无菌培养基中，按照实验要求进行培养，保持适宜的温度和湿度。
3.4 细胞收获和处理：在培养达到一定密度后，使用离心机将培养物离心，收集上清液。
将上清液转移至无菌离心管中，并进行离心，去除细胞沉淀。
3.5 细胞标本制备：将细胞沉淀转移至无菌离心管中，加入适量的无菌生理盐水悬浮细胞，然后将悬浮细胞制备成片玻片或涂布于无菌培养皿上。
3.6 烘干和固定：将制备好的片玻片或培养皿放入培养箱中，保持适宜的温度和湿度进行烘干固定，使细胞附着于玻片或培养皿上。
3.7 染色和观察：使用适当的染色方法对细胞进行染色，并通过显微镜观察细胞状态和无菌性。
3.8 结果判断：根据染色结果和观察到的细胞状态判断细胞是否具有无菌性。
4. 注意事项4.1 操作时需佩戴无菌手套，避免污染试剂和培养器具。
4.2 使用无菌移液器和管道处理液体，避免交叉污染。
细胞培养无菌操作
细胞实验考核要点一、准备工作1、清点超净台中仪器物品（垃圾桶、饭盒中三种管、橡胶塞、蓝枪头、移液枪、电子枪、50ml离心管、镊子、剪刀、marker笔、打火机、卫生纸、6孔板、平衡50ml内含1ml离心管），合理布置台面。
2、超净台灭菌：酒精喷洒超净台面，紫外照射20min左右。
3、预热：将PBS、10%FBS、胰酶装进PE手套中，37℃预热备用。
二、实际操作1、点燃酒精灯2、从水浴锅中取出预热的三种液体，喷酒精后放入超净台，用卫生纸擦拭瓶壁酒精。
撕开三个封口膜。
瓶口在外焰烧灼烧，拧松三个瓶盖，以备用。
3、手喷酒精后，旋松并取出T25瓶。
在显微镜下观察细胞长势，若细胞密度达到了80%-90%，则可以进行传代。
注意若显微镜没有人用过，需要在载物台附近喷洒酒精后擦拭。
4、将T25拿到超净台里面。
手进入台面内需酒精喷洒消毒（后不赘述）。
打开吸泵。
5、来回灼烧吸泵铁头。
旋开T25瓶，注意灼烧瓶盖，瓶盖扣放。
铁头插上两个蓝枪头，瓶身倾斜吸去瓶中原培养基。
灼烧瓶盖和瓶口后盖盖，不要盖太紧。
6、取1ml移液枪，将T25竖起来，向未生长细胞的侧壁打入5ml PBS冲洗。
盖盖后左右上下稍移动。
将PBS吸出。
关吸泵！7、向瓶中加入500ul胰酶。
稍混合均匀。
放入培养箱中消化2min。
计时。
8、2min内需完成的操作（1）取出一个50ml离心管。
（2）烧套管：镊子在火上过一下，套管盒稍稍开一小口，用镊子取出一个套管，火上来回灼烧，然后放置在离心管架上。
（3）烧弯头吸管：从烧瓶中用镊子取出一个塞子。
弯头吸管盒稍开一小口，确定是不是塞棉花的一头。
镊子稍稍过火灼烧，开一小口，镊子夹出塞棉花一头，放下镊子，拿出吸管。
盒子放回原处。
将塞子塞入弯头吸管中。
手持塞子来回在火上灼烧，完毕后放入套管中。
9、取出培养箱中消化的细胞，显微镜及肉眼观察消化是否合适。
若在显微镜下看到细胞质壁分离呈球形，大部分细胞已经脱离瓶壁游走在视野中，肉眼观察有白色的成片细胞脱落，说明消化完成。
细胞培养无菌操作基本技术
细胞培养无菌操作基本技术细胞培养是现代生物学研究中常用的一种实验技术，能够使细胞在体外条件下生长和繁殖。
无菌操作是细胞培养过程中非常重要的一项技术手段，可以保证细胞培养环境的无菌纯净，避免细胞被外部微生物污染。
本文将介绍细胞培养中常用的无菌操作基本技术，并结合实例进行详细说明。
无菌操作基本技术主要包括以下几个方面：1.实验前准备在进行无菌操作前，首先需要准备好实验所需的培养基、培养器具和其他实验工具。
这些器具和工具需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌。
此外，实验人员还需佩戴无菌手套、穿戴无菌实验服，并对实验台面进行彻底的清洁消毒，保持实验环境的无菌。
2.灭菌操作在进行无菌操作前，需要对培养器具进行灭菌处理。
常用的灭菌方法有干热灭菌和湿热灭菌两种。
干热灭菌是将培养器具置于高温烘箱中，持续加热若干小时，以达到灭菌目的。
湿热灭菌则是将培养器具置于高压高温的蒸汽中，进行高压灭菌。
此外，对于一些无法耐受高温高压的培养器具，还可使用化学灭菌方法，如使用过氧化氢和酒精进行消毒。
3.无菌操作技术在进行无菌操作时，需要遵循一定的操作规范。
首先，实验人员应将实验器具放入无菌工作台中，在UV灯的照射下进行灭菌处理。
然后，实验人员需要将自己的双手放入无菌手套中，并使用无菌皮培养工具进行操作。
接下来，需要准备好含有培养基的培养皿，并用无菌注射器将细胞转移到培养皿中。
在操作过程中，需要注意避免造成培养基的污染，尽量减少对培养基的接触时间，以防止细菌或其他微生物的污染。
4.维持无菌操作环境在进行细胞培养过程中，需要维持无菌操作环境。
实验人员应避免在实验台面上散落细胞培养基、细胞碎片或其他可能造成污染的物质。
细胞培养箱和无菌安全柜的门不可长时间打开，以防止空气中的微生物进入工作区域。
并且需要定期对无菌安全柜和细胞培养箱进行清洁和消毒。
同时，实验室人员需要经常进行手部清洁，并定期更换无菌手套和实验服，保持实验环境的无菌。
细胞培养中的无菌操作是进行细胞培养实验的基础，能够产生可靠的实验数据，并在细胞学研究中发挥重要作用。
细胞培养—无菌操作
细胞培养—无菌操作细胞培养是一种常见的生物技术操作，可以用来研究细胞的生理功能、细胞的增殖和分化以及生物化学反应等。
在进行细胞培养时，无菌操作至关重要，因为细胞非常容易受到外部微生物的污染，从而影响实验结果的准确性。
下面将介绍细胞培养的无菌操作步骤。
1.准备工作在进行细胞培养之前，需要准备好以下工具和试剂：-培养皿：使用符合实验要求的培养皿，常见的有培养瓶、细胞培养板等。
-培养基：根据实验需要选择适当的培养基，例如DMEM、RPMI-1640等。
-无菌操作台：无菌操作台提供一个无菌的工作环境，可以防止微生物的污染。
-显微镜：显微镜可以用来观察细胞的形态和增殖情况。
-移液器和吸头：用于移液操作，需要保持无菌。
-无菌培养液：例如乙醇、连苯三氯和消毒液等。
-消毒器材：例如灭菌器、高压蒸汽灭菌器和紫外线灭菌器等。
2.准备培养皿和培养基将培养皿放入无菌操作台的工作区域内，通过高压蒸汽灭菌器或紫外线灭菌器对培养皿进行灭菌处理，确保其表面无菌。
然后用无菌移液器加入适量的培养基到培养皿中，根据实验需要选择适当的培养基。
3.细胞接种将需要进行细胞培养的细胞按照预定的密度接种到培养皿中。
在进行细胞接种前，需要将细胞培养液中的细胞进行离心，去掉上清液，然后用适量的培养基将细胞悬浮液稀释到适当的细胞密度。
在接种细胞时需要注意，避免将培养皿的口部接触到任何表面，以免引入微生物污染。
4.细胞培养将接种好的细胞培养皿放入细胞培养箱或培养箱中进行培养，保持适当的温度和湿度。
通常将细胞培养箱设置在37摄氏度，5%二氧化碳的环境中，以模拟人体体内的条件。
在细胞培养过程中需要定期检查细胞的状态，观察细胞的形态和增殖情况。
5.细胞培养的无菌操作在培养细胞的整个过程中，需要保持无菌操作。
在进行任何操作之前，需要在无菌操作台上烧毁以杀死细菌和真菌。
接种细胞、更换培养基、观察细胞等一系列操作都需要在无菌操作台上进行，以减少细胞受到外部污染的机会。
细胞培养中无菌操作注意事项
细胞培养中无菌操作注意事项细胞培养是一种在无菌条件下培养和繁殖细胞的技术。
无菌操作是细胞培养中至关重要的一步，能够避免外源性微生物的污染，确保细胞的纯度和健康状态。
下面将介绍细胞培养中的无菌操作注意事项。
1.实验前准备：a.保持实验室环境清洁整洁，保证无尘、无杂物的操作台。
b.确保实验室设备（如培养箱、无菌工作台等）处于良好的工作状态。
c.准备充足的培养基、培养器具和试剂，并保证其无菌。
d.穿着干净的实验服、戴上帽子和手套。
2.无菌工作台使用：a.将无菌工作台开启至少30分钟，以确保过滤系统充分运行，并使工作区域完全无菌。
b.在无菌工作台上进行所有操作，避免在无菌环境外开启培养皿或试管。
c.打开和关闭无菌工作台的过程中，手部和工具都应靠近吸力孔，以防被外界的空气污染。
3.消毒：a.经常清洁操作台面、墙面和设备表面，使用70%酒精或其他消毒剂擦拭。
b.外科手术型手套应使用无菌消毒的方法洗手，并将手套顶部折叠入实验服袖口内。
4.包装的无菌器具的使用：a.避免直接触碰培养皿内表面，以防止菌落的扩散。
b.轻轻解开无菌器具的外包装，避免将外包装上的细菌污染到器具上。
c.使用无菌吸管时，保证吸管顶端不接触任何表面。
5.无菌培养基的制备和使用：a.在无菌工作台上制备培养基，使用消毒剂擦拭培养瓶的瓶口，以避免细菌进入培养基中。
b.使用严格无菌操作规范，避免对培养瓶瓶口、移液器以及培养皿内部进行接触，以防止细菌或真菌等污染物进入培养基。
c.每次使用前，验证培养基是否真的无菌，如通过看培养基是否有溶菌圈形成等方法进行验证。
6.细胞传代过程中的无菌操作：a.检查细胞培养器和培养槽是否处于良好的状态，确保无裂纹、附着物残留等问题，以防止外源性的细菌感染。
b.每次传代前，使用无菌的PBS等缓冲液冲洗细胞，以去除培养基中的残留物。
c.使用无菌的移液器和无菌的培养皿转移细胞，避免细胞接触受污染的物体。
7.培养皿的密封和存放：a.使用无菌胶带将培养皿的盖与底部紧密密封，以防止细菌、真菌等污染物进入。
无菌技术的概念及操作原则
无菌技术的概念及操作原则
无菌技术是一种重要的实验室操作技术，用于防止外源菌的污染，并保持实验环境的无菌状态。
它主要用于细胞培养、微生物学实验、分子生物学实验等各种实验中。
无菌技术的操作原则如下：
1. 严格的个人卫生：进行无菌技术操作时，操作人员必须穿戴干净的实验服，并戴上手套、口罩和护目镜，以防止人员带入细菌等微生物。
2. 消毒操作：在操作过程中，使用已经消毒的仪器、培养皿、培养液等物品。
一般情况下，使用75%的酒精进行表面消毒，或者使用高压蒸汽灭菌器进行物品的高温高压消毒。
3. 实验环境控制：实验室内必须保持良好的清洁环境，定期进行实验室清洁和通风，减少空气中的微生物污染。
4. 空气过滤：在需要进行无菌操作的环境中，可以采用空气过滤器，过滤掉悬浮的微生物颗粒，以减少空气传播的细菌。
5. 炉灭菌和紫外线消毒：实验室中可以使用高温高压灭菌器对试验装置和实验用品进行消毒，也可以使用紫外线消毒灯照射工作区域，杀灭细菌。
6. 快速操作和密封容器：在进行无菌技术操作时，应该尽可能快速进行，以减少无菌环境的有效时间。
同时，将实验物品放
入密封的容器中，以防止空气中的微生物进入。
7. 传递物品的方法：在进行无菌技术操作时，应该采用合适的方法传递物品，如用酒精烧灼工具，用无菌钳取物品等，以减少细菌的污染。
总之，无菌技术的操作原则旨在最大程度上防止外源性细菌的污染，确保实验结果的准确性和可靠性。
细胞培养中无菌操作技术
细胞培养中无菌操作技术无菌操作技术是细胞培养中非常重要的一项技术，它可以保证细胞培养中的杂菌和细菌等微生物污染得到很好的控制，从而确保细胞培养的成功率和生长质量。
本文将详细介绍细胞培养中常用的无菌操作技术及其步骤。
无菌操作技术主要包括无菌操作环境的建立、实验用具的无菌处理、培养基的无菌处理以及细胞的取样和传代等。
无菌操作环境的建立是无菌操作的基础，它可以通过消毒和建立无菌罩来实现。
常用的消毒方法包括酒精消毒、紫外线消毒和高温高压灭菌等。
在建立无菌罩时，应注意选择合适的位置，确保周围环境的清洁，同时要确保无菌罩内部的无菌条件。
实验用具的无菌处理是无菌操作中的重要步骤之一、在实验开始前，应将所需的实验用具经过高温高压灭菌或酒精消毒处理。
对于一次性使用的实验用具，可以选择购买已经经过无菌处理的产品。
在实验中，应避免直接接触实验用具，使用无菌吸管或钳子等工具进行操作，减少细菌的接触。
培养基的无菌处理是细胞培养中的重要步骤之一、在使用培养基前，应将培养基经过高温高压灭菌或过滤器进行无菌处理。
如果使用过滤器进行无菌处理，应注意选择合适的滤器孔径，以防止细菌的通过。
在开启培养基瓶盖时，应注意不要直接接触瓶盖内部，以免污染培养基。
细胞的取样和传代也是无菌操作中的重要步骤。
在取样前，应将操作区域经过酒精消毒，并在无菌罩中进行操作。
使用无菌吸管或针管取样，避免与容器的边缘接触，防止边缘的污染。
在传代过程中，应使用无菌吸管或针管将细胞转移至新的培养基中，避免污染。
除了以上介绍的无菌操作技术，细胞培养中还有一些其他注意事项：在培养室内要注意定期消毒，保持环境的无菌；操作时要避免打喷嚏、咳嗽等行为，防止唾液中的微生物污染实验；尽量避免与其他人员同时进行细胞培养操作，以免相互污染。
总之，无菌操作技术是细胞培养中的重要技术之一，它可以有效控制细胞培养中的微生物污染，确保细胞培养的成功率和生长质量。
在无菌操作中，建立无菌操作环境、实验用具的无菌处理、培养基的无菌处理以及细胞的取样和传代等步骤都是非常重要的。
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细胞培养中的无菌技术：
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。
操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管、吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在台面的中央无菌区域，勿在边缘的非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开的容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染的细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的无菌操作台(至少Class II)。
操作过程中，应避免引起aerosol 的产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头的伤害等。
5. 定期检测下列项目：
5.1. CO2 钢瓶的CO2 压力
5.2. CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内的airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。