含溶栓颗粒血清对肿瘤坏死因子α损伤大鼠脑微血管内皮细胞间粘附分子1的影响

含溶栓颗粒血清对肿瘤坏死因子-α损伤大鼠脑微血管内皮细胞间粘附分子-1的影响作者：臧运华,唐明,郭瑞友,叶俊丽,王燕鸣,郑燕【摘要】目的探讨溶栓颗粒对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)损伤血管内皮细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。

方法用TNF-α(40 ng/mL)损伤大鼠脑皮质微血管内皮细胞(BMECs)造模,用含大、中、小剂量溶栓颗粒和中等剂量阿托伐他汀的大鼠血清干预受损BMECs,应用HE染色观察细胞形态变化,免疫组化法观察ICAM-1的表达。

结果TNF-α可以造成BMECs损伤,表现为细胞数量下降、皱缩。

受损细胞的ICAM-1表达明显增多。

含大、中、小剂量溶栓颗粒和阿托伐他汀的大鼠血清能减少ICAM-1表达。

中等剂量阿托伐他汀的这一作用与大、中剂量溶栓颗粒相当。

结论溶栓颗粒可以减少因炎性介质TNF-α增加而受损的血管内皮细胞ICAM-1表达,或许可以减缓动脉粥样硬化形成,并对稳定动脉粥样斑块有积极作用。

【关键词】溶栓颗粒;阿托伐他汀;大鼠;脑微血管内皮细胞;细胞间粘附分子-1;肿瘤坏死因子-αAbstract：Objective To study the effect of Rongshuan Grain on the expression of ICAM-1 of brain microvascular endothelial cells (BMECs) injured by TNF-α. Methods TNF-α (40 ng/mL) was used to damage the BMECs. The serum of rats containing different dosage of Rongshuan Grain and moderate dosage of Atorvastatin were used to intervene the damaged BMECs. Themorphological changes was observed by HE staining and the expression of ICAM-1 by immunohistochemical method. Result TNF-α damaged the BMECs, manifestations included that the cell number decreased, the cell shape changed to crimple. The expression of ICAM-1 of damaged BMECs increased. The serum containing high, moderate and small dose of Rongshuan Grain and moderate dose of Atorvastatin reduced the expression of ICAM-1. The effect of moderate dose of Atorvastatin was the same as high and moderate dose of Rongshuan Grain. Conclusion Rongshuan Grain can reduce the expression of ICAM-1 of BMECs damaged by TNF-α. The function may decrease the formation of atherosclerosis and be effective on the stabilization of atheromatous plaque.Key words：Rongshuan Grain;Atorvastatin;rats;BMEC;ICAM-1;TNF-α动脉粥样硬化是脑血管疾病的重要病理基础之一。

现代医学认为,血管内皮功能受损,发生氧化应激与炎症反应,诱发各种炎性因子的分泌,启动了动脉粥样硬化的病理过程[1]。

细胞间粘附分子-1(ICAM-1)属于免疫球蛋白超家族粘附分子,是一种单链跨膜糖蛋白,在白细胞与血管内皮细胞稳定粘附中发挥重要作用[2]。

ICAM-1表达于内皮细胞,并促使其向血管周围浸润,导致组织的炎症和损害。

溶栓颗粒是在临床治疗缺血性中风病的有效方剂基础上研制的。

前期研究发现,溶栓颗粒对大鼠缺血再灌注损伤有一定保护作用,能减少缺血再灌注脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性介质产生及ICAM-1表达[3-4]。

本研究探讨溶栓颗粒对血管内皮细胞ICAM-1的影响。

1 材料与方法1.1 动物Wistar大鼠20只,雄性,体质量250～280 g,购自青岛市药检所实验动物中心。

许可证号：SCXK(鲁)。

1.2 细胞及试剂大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs),购自北方伟业科技有限公司。

DMEM和10%胎牛血清(美国Gibco公司),多聚赖氨酸(AR0003)、复合消化液(AR0022)、ICAM-1(BA0541)免疫组化试剂盒、SABC免疫组化试剂盒(SA1022)均购自武汉博士德科技有限公司,TNF-α(105-01)购自上海天呈生物信息科技有限公司。

1.3 药物溶栓颗粒由柴胡、枳实、川芎、泽兰、丹参、地龙、水蛭等组方,每包10 g,青岛市海慈医疗集团制剂实验室提供。

阿托伐他汀钙片(立普妥),辉瑞制药有限公司生产,批号。

1.4 分组及含药血清制备20只Wistar大鼠随机分为5组,分别为正常血清组、大剂量血清组(10 g溶栓颗粒溶于40 mL蒸馏水)、中剂量血清组(10 g溶栓颗粒溶于80 mL蒸馏水)、小剂量血清组(10 g溶栓颗粒溶于160 mL 蒸馏水)、立普妥血清组(20 mg立普妥溶于240 mL蒸馏水),每组4只。

以上各组分别灌胃蒸馏水及相应药物2 mL,2次/d,连续2 d,第3日给药1次。

最后1次给药后1 h,大鼠不麻醉固定,腹主动脉取血,分离血清,过滤除菌后置-20 ℃保存。

用于细胞时,预先56 ℃、30 min灭活。

1.5 细胞培养BMECs用含有10%胎牛血清的DMEM培养液,置孵箱(37 ℃, 5%CO2)培养。

镜下细胞计数,待细胞达对数增长期,分为7组,接种于24孔培养板,为空白组、模型组、正常血清组、立普妥组及溶栓颗粒大、中、小剂量组。

分组后置37 ℃、5%CO2培养箱孵育,除空白组外各组加入TNF-α(40 ng/mL)孵育 6 h,用含药血清处理24 h后检测。

空白组：BMECs+DMEM培养液;模型组：BMECs+DMEM培养液+TNF-α孵育。

正常血清组：BMECs+DMEM培养液+TNF-α孵育+正常血清组血清。

大剂量组：BMECs+DMEM培养液+TNF-α孵育+溶栓颗粒大剂量含药血清。

中剂量组：BMECs+DMEM培养液+TNF-α孵育+溶栓颗粒中剂量含药血清。

小剂量组：BMECs+DMEM培养液+TNF-α孵育+溶栓颗粒小剂量含药血清。

立普妥组：BMECs+DMEM培养液+TNF-α孵育+立普妥含药血清。

1.6 细胞间粘附分子-1检测按照免疫组化试剂盒说明和预实验经验进行。

1.7 培养细胞形态观察采用HE染色,光镜下观察。

1.8 统计学方法应用PEMS3.1统计软件进行分析。

阳性细胞率用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 形态学观察模型组、正常血清组BMECs细胞数量下降,皱缩、变形,分裂相细胞明显增加,细胞形态发生明显变化,血管内皮细胞部分呈明显的长梭形、星形,似成纤维细胞样改变,细胞间隙增大。

溶栓颗粒大、中、小剂量组及立普妥组细胞密度大于模型组及正常血清组,皱缩变形细胞较少。

2.2 细胞间粘附分子-1蛋白表达胞浆、核膜棕黄色颗粒的是阳性细胞。

空白组BMECs胞浆内没有或有少量棕黄色颗粒,染色很浅。

模型组、正常血清组有较多细胞胞浆内棕黄色颗粒,染色较深。

溶栓颗粒大、中剂量组胞浆含黄色颗粒细胞较少,染色较浅。

各组阳性细胞数量比较见表1。

表1 各组ICAM-1蛋白表达阳性细胞数量比较3 讨论正常情况下ICAM-1呈低表达,某些细胞因子及炎症介质是促进粘附分子上调的信号因子,如白细胞介素-1β(IL-1β)在脑缺血时迅速表达,使ICAM-1上调[5]。

细胞培养的研究结果表明,单纯缺氧不能刺激血管内皮细胞表达ICAM-1,而炎症介质IL-1β和TNF-α对其具有强烈的诱导作用[6]。

TNF-α、IL-6、IL-8也在缺血中扮演了重要炎性介质的角色。

本研究参考相关文献[7],用40 ng/mL TNF-α孵育BMECs 6 h,发现ICAM-1表达明显增加,而没有TNF-α损伤的BMECs很少表达ICAM-1。

说明TNF-α造成损伤的BMECs表达ICAM-1明显增多可能是动脉粥样硬化的机制之一。

TNF-α损伤的BMECs分裂相细胞增多,而既往未见报道ICAM-1增加细胞分裂,可能与细胞受损后自身修复增强有关,也可能有其他机制参与。

前期研究发现溶栓颗粒有减少缺血再灌注大鼠TNF-α表达的作用,并减少ICAM-1表达[3-4]。

本研究应用外源性TNF-α损伤血管内皮细胞,用含溶栓颗粒的大鼠血清进行干预时,仍减少了ICAM-1表达,说明溶栓颗粒减少ICAM-1表达的作用并不单纯从减少TNF-α表达的间接途径实现,可能也有直接减少ICAM-1表达的途径。

大剂量和中剂量溶栓颗粒的这一作用与中等剂量阿托伐他汀程度相当,而且含溶栓颗粒大鼠血清干预的BMECs分裂相细胞数量也有所减少,说明溶栓颗粒还有减少受损BMECs分裂增殖的作用。

Printseva等[8]第一次证明了人动脉粥样硬化病变中内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞表达ICAM-1,其中脂纹病变表达量最大。

正常人动脉内皮及斑块以外的内膜和平滑肌细胞不表达或仅轻微表达ICAM-1。

他们认为,ICAM-1在内皮细胞表达涉及单核细胞和淋巴细胞向内皮的粘附及迁移。

一系列研究表明,白细胞与内皮细胞的粘附是以炎性因子为主的多种机制激发的,ICAM-1是关键因素[9-11]。

溶栓颗粒,尤其是大剂量溶栓颗粒,可以直接干预ICAM-1这一白细胞与内皮细胞粘附,从而减缓动脉粥样硬化形成。

另外,溶栓颗粒减少血管内皮细胞分裂增殖,对稳定动脉粥样斑块或许有积极作用。

【参考文献】[1] 王拥军.氧化应激与缺血性脑血管病[J].中国卒中杂志,2008,3(3)：163-165.[2] 孔宪寿.细胞粘附分子[J].国外医学·分子生物学分册,1994,16(1)：1-5.[3] 曹晓岚,任丽,臧运华.溶栓颗粒对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2005,3(1)：37-38.[4] 曹晓岚,臧运华,贺青涛,等.溶栓颗粒对急性缺血再灌注损伤大鼠脑组织IL-1β及ICAM-1的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2006,4(3)：219-220.[5] Yamasaki Y, Matsuura N, Shozuhara H, et al. Interleukin-1 as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats[J]. Stroke,1995,26(4)：676-680.[6] Zund G, Dzus AL, McGuirk DK, et al. Hypoxic stress alone does not modulate endothelial surface expression of bovine electin and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)[J]. Swiss Surg Suppl, 1996,1：41-45.[7] 孙杰,郭振辉,赖添顺,等.山莨菪碱对血管内皮细胞损伤保护机制的实验研究[J].军事医学科学院院刊,2008,32(2)：137-161.[8] Printseva OY, Peclo MM, Gown AM. Various cell types in human atheroscoerotic lesions express ICAM-1;Further immunocytochemical and immunochemical studies employing monoclonal antibody,10F3[J]. Am J Pathol,1992,140(4)：889-896.[9] Zhang RL, Chopp M, Zaloga, et al. The temporalprofiles of ICAM-1 protein and mRNA expression after transient MCA occlusion in the rat[J]. Brain Res,1995,682(1/2)：182-188.[10] Wang X, Yue TL, Barone FC, et al. Demonstration of increased endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 mRNA expression in rat ischemic cortex[J]. Stroke,1995,26(9)：1665-1669.[11] Lindsberg PJ, Carpen O, Paetau A, et al. Endothelial ICAM-1 expression assiociated with inflammatory cell response in human ischemic stroke[J]. Circlulation,1996,94(5)：939-945.。