寒兰离体化学诱变研究

Q260046902 专业做论文编号：论文题目寒兰离体化学诱变研究The Research on Chemical Mutation in Vitroof Cymbidium Kanran Makino专业名称：植物学专业代码： 071001种类（在相应方框内打√）：统招博士□统招硕士□同等学力人员申请硕士学位□工程硕士□高校教师在职攻读硕士学位□公共管理□工商管理□摘要摘要本文以甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、秋水仙素(colchicines)、咖啡碱(caffein)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、马来酰肼(MH)、亚硫酸钠(Na2SO3)为化学诱变剂，以寒兰(Cymbidium kanran Makino)原球茎为材料进行离体化学诱变研究，探讨这7种化学诱变剂对寒兰原球茎生长、增殖和分化的效应，筛选适宜的诱变浓度和时间，以形态学方法鉴定再生植株的表型变异，以细胞学方法观察化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响，并分析诱变后的再生植株在生理生化指标的变化，以ISSR–PCR 扩增体系对化学诱变剂造成的寒兰遗传物质的改变进行了初步分析。

结果表明：1. 各化学诱变剂对寒兰原球茎的生长均有一定的抑制作用，随着浓度升高或时间的延长，原球茎的褐变率和死亡率升高，褐变率始终小于死亡率。

2. 各化学诱变剂对寒兰原球茎的增殖均有一定的抑制作用，随着浓度升高或时间的延长，原球茎的死亡率升高。

增殖率和绝对生长速度的变化与处理浓度和时间之间并非简单的相关关系。

3. 通过对各处理结果的分析，计算了7种诱变剂对寒兰原球茎的半致死量，它与浓度和时间都有关系，可作为寒兰离体化学诱变的参考剂量。

4. 再生植株在表型上均有一定的变异，主要以叶色变黄为主。

其中EMS 和秋水仙素处理后原球茎的再生植株表型变异显著，但是表型变异再生植株的比率并不高。

5. 各化学诱变剂都能在细胞学水平对寒兰根尖细胞核造成明显改变，主要有畸形核、微核、多核、核破裂、核质浓缩、染色体畸变(加倍、滞后、缺失)等现象。

6. 再生植株可溶性糖含量较正常植株有不同程度的升高；EMS、DES、秋水仙素和Na2SO3处理后的原球茎再生植株的可溶性蛋白含量增高，咖啡碱、5-BU、马来酰肼处理后的原球茎再生植株的可溶性蛋白含量降低。

7. 再生植株的可溶性蛋白质图谱、超氧物歧化酶同工酶酶谱、酯酶同工酶酶谱、过氧化氢酶同工酶酶谱、过氧化物酶同工酶酶谱较正常植株有不同程度的变化，存在条带的减少和增加现象。

8.再生植株和正常植株之间的基因组ISSR扩增图谱条带均有差异性，其中EMS、DES、5-BU诱变处理后再生植株的基因组扩增条带差异性较其I摘要他诱变剂的明显。

关键词：寒兰；原球茎；化学诱变IIAbstractABSTRACTUsing EMS, DES, colchicines, caffeine, 5-BU, MH, Na2SO3 as mutagenic agents, and using the PLBs of Cymbidium kanran Makino as material, we studied the tech- nique of mutagen in vitro. This article researched the effects on growth, proliferation and differentiation of PLBs treated with mutagenic agents, chosed appropriate concentration and time, used technique of morphologic to check up phenotypic mutation, used cytological technique to observe the influences on karyons of root tip, analyzed the physiological and biochemical change of plants from PLBs treated with mutagenic agents, at last, used ISSR–PCR amplified system to analyze the change on genome of plants from PLBs treated with mutagenic agents. The results were as follows:1.Each mutagenic agent could resrain the growth of PLBs, with the increase of concentration and the prolonged time, the brown ratio and death ratio rised, the brown ratio were always less than death ratio.2.Each mutagenic agents could resrain the proliferation of PLBs, with the increase of concentration and the prolonged time, the death ratio rised, the connection between proliferation rate and absolute growth rate were not simple correlativity.3.Analyzing the results, we calculated the LD50 on PLBs of mutagenic agents, it related to concentration and time, the results could be the referenced dosage for chemical mutation of Cymbidium kanran Makino.4.Some phenotypic mutation appeared on plants from PLBs treated with mutagenic agents, mostly were flavicant leafs. The distinct phenotypic mutation mostly appeared on the plants treated with EMS and colchicines. The percentage of phenotypic mutation were not high.5.Each mutagenic agent could change karyons of root tip on cytological level, mostly were abnormal karyons phenomena, micronucleus phenomena, multinucleus phenomena, cracked karyons phenomena, concentrated karyoplasms phenomena, chromosome aberrance phenomenon(double, lag, deletion).6.The soluble sugar content of the plants from PLBs treated with muta- genic agents were higher than normal plants;the soluble protein content of plants fromIIIAbstractPLBs treated with EMS, DES, colchicines, Na2SO3 were higher than normal plants, the soluble protein content of plants from PLBs treated with caffeine, 5-BU, MH were lower than normal plants.7.The soluble protein bands, SOD isozyme bands, EST isozyme bands, CAT isozyme bands and POD isozyme bandsof plants from PLBs treated with 7 mutagenic agents were different from normal plants, existed the phenomenon of absent bands or added bands.8.The ISSR-PCR amplified genome bands of plants from PLBs treated with mutagenic agents were different from normal plants, compared with other mutagenic agents, there distinct differences on genome bands between plants from PLBs treated with EMS, DES, 5-BU and normal plants.KeyWords:Cymbidium kanran Makino;PLBs; Chemical mutationIV缩略符号注释缩略符号注释EMS ethyl methane sulfonate 甲基磺酸乙酯DES diethyl sulfate 硫酸二乙酯5-BU 5-Bromouracil 5-溴尿嘧啶MH maleic hydrazide 马来酰肼MS Murashige Skoog MS培养基6-BA benzy ladenine 6-苄基氨基嘌呤NAA naphthalena acetic acid 萘乙酸PLBs protocorn-like bodies 原球茎min minute 分钟h hour 小时d day 天s second 秒r rotation 转rpm round per minute 转/分Tris tris(hydroxymethyl)aminoethane 三(羟甲基)氨基甲烷SDS sodium lauryl sulfate 十二烷基硫酸钠TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine N,N,N',N'-四甲基二乙胺NBT nitro blue terazolium 氮蓝四唑PMS phenazine methosulphte 酚嗪硫酸甲酯NAD nicotinamide adenine dinucleotide nadide 辅酶ⅠMTT thiazolyl blue 噻唑兰SOD superoxidae dismutase 超氧物歧化酶EST esterase 酯酶MDH malate dehydrogenase 苹果酸脱氢酶CAT catalase 过氧化氢酶POD peroxidase 过氧化物酶PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应V目录目录第1章绪论 (1)1.1 组织培养是保护兰花种质资源的有效手段 (1)1.2 人工诱变是获得兰花新品种的技术措施 (3)1.2.1 诱变育种的发展过程及现状 (3)1.2.1.1自发突变给人工诱变育种引发的思路 (3)1.2.1.2 人工诱变育种的产生和发展 (4)1.2.1.3 人工诱变的原理 (5)1.3 诱变技术与植物组织培养结合的方式 (6)1.3.1 诱变与茎尖培养结合 (6)1.3.2 诱变与单倍体育种技术结合 (6)1.3.3 诱变结合其它器官外植体及愈伤组织培养结合 (7)1.4 诱变技术与组织培养相结合在兰花育种中的应用 (7)1.5 诱变与植物组织培养结合过程中应注意的问题 (9)1.6 突变的筛选 (10)1.6.1 形态学和细胞学方法 (11)1.6.2 生理生化方法 (11)1.6.3 现代分子生物学方法 (11)1.7存在的问题 (12)1.8 展望 (13)1.8.1 新复合育种思路 (13)1.8.2 多倍体育种 (13)1.8.3 嵌合体的利用 (14)1.8.4 兰花试管成花技术的应用 (14)1.8.5 拓宽辐射源和诱变剂的使用范围 (14)1.9 本课题研究的目的、意义及主要内容 (15)1.9.1 研究目的及意义 (15)1.9.2 主要研究内容 (15)1.9.2.1 化学诱变剂对寒兰原球茎生长、增殖和分化影响 (15)VI目录1.9.2.2 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响 (15)1.9.2.3 化学诱变剂对寒兰生理生化指标的影响 (16)1.9.2.4 化学诱变剂对寒兰遗传物质的影响 (16)第2章寒兰原球茎的化学诱变及再生植株的形态观察 (17)2.1 材料与方法 (17)2.1.1材料 (17)2.1.1.1 实验材料 (17)2.1.1.2 化学诱变剂 (17)2.1.1.3 培养基及培养条件 (17)2.1.2 方法 (18)2.1.2.1 寒兰原球茎的诱导 (18)2.1.2.2 化学诱变处理 (18)2.1.2.3 处理材料的培养和观察 (18)2.1.2.4 数据处理与统计方法 (18)2.2 结果 (19)2.2.1 化学诱变剂对原球茎生长的影响 (19)2.2.2化学诱变剂对原球茎增殖的影响 (24)2.2.3 半致死剂量的确定 (31)2.2.4 对再生植株的形态学观察 (32)2.2.4.1 EMS (32)2.2.4.2 DES (32)2.2.4.3 秋水仙素 (32)2.2.4.4 咖啡碱、5-BU、马来酰肼、亚硫酸钠 (32)2.3 分析 (34)第3章化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响 (36)3.1 材料与方法 (36)3.1.1 材料 (36)3.1.2 方法 (36)3.2 结果 (37)3.2.1 正常根尖的染色体数和细胞核形态 (37)VII目录3.2.2 化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响 (37)3.2.2.1 EMS对寒兰根尖细胞核的影响 (37)3.2.2.2 DES对寒兰根尖细胞核的影响 (37)3.2.2.3 秋水仙素对寒兰根尖细胞核的影响 (38)3.2.2.4 咖啡碱对寒兰根尖细胞核的影响 (38)3.2.2.5 5-BU对寒兰根尖细胞核的影响 (38)3.2.2.6 马来酰肼对寒兰根尖细胞核的影响 (38)3.2.2.7 Na2SO3对寒兰根尖细胞核的影响 (38)3.3 分析 (39)第4章化学诱变剂对寒兰生理生化指标的影响 (42)4.1 材料与方法 (42)4.1.1 材料 (42)4.1.2 方法 (42)4.1.2.1 可溶性蛋白质含量的测定 (42)4.1.2.2 可溶性糖含量的测定 (43)4.1.2.3 SDS-PAGE不连续电泳 (43)4.1.2.4同工酶电泳 (45)4.2 结果 (49)4.2.1 化学诱变剂对可溶性糖含量的影响 (50)4.2.2 化学诱变剂对可溶性蛋白质含量的影响 (50)4.2.3 化学诱变剂对寒兰可溶性蛋白质组分的影响 (50)4.2.4 化学诱变剂对寒兰同工酶的影响 (53)4.2.4.1 超氧化物岐化酶同工酶(SOD)酶谱 (59)4.2.4.2 酯酶同工酶(EST)酶谱 (59)4.2.4.3 苹果酸脱氢酶同工酶(MDH)酶谱 (59)4.2.4.4 过氧化氢酶同工酶(CAT)酶谱 (59)4.2.4.5 过氧化物酶同工酶(POD)酶谱 (59)4.3 分析 (60)第5章化学诱变剂对寒兰遗传物质影响的初步分析 (61)5.1 材料和方法 (61)VIII目录5.1.1 材料 (61)5.1.2试剂和设备 (61)5.1.3 试剂配置 (62)5.1.4 方法 (62)5.1.4.1 材料DNA的提取 (62)5.1.4.2 ISSR分子标记PCR扩增 (63)5.2 结果 (63)5.3 分析 (65)第6章讨论 (67)6.1 讨论 (67)6.1.1 染色体畸变 (67)6.1.2 点突变 (68)6.1.2.1 EMS和DES(烷化剂类诱变剂) (68)6.1.2.2 咖啡碱、5-溴尿嘧啶、马来酰肼(碱基类似物类诱变剂) (69)6.1.2.3 亚硫酸钠(无机化合物类诱变剂) (70)第7章结论及建议 (71)7.1 结论 (71)7.2 建议 (72)7.2.1 复合诱变手段 (72)7.2.2. 缩短营养生长期 (72)7.2.3 与分子生物学的结合 (73)参考文献 (74)图版Ⅰ (78)图版Ⅱ (80)读研期间已发表论文 (80)IX第1章绪论第1章绪论寒兰(Cymbidium kanran Makino)，兰科兰属中的地生兰，生长于海拔400～2400米，主要分布在江西、台湾、福建、浙江、湖南、广东、广西和四川等地，也见于日本和朝鲜半岛南端。