白色念珠菌菌液制备
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌是一种常见的真菌，可以在人体、动物和植物体内产生感染。
为了深入了解其生物学特性和病原机制，研究人员需要大量高质量的白色念珠菌原生质体。
制备白色念珠菌原生质体的方法主要有两种：机械破碎法和酵素消化法。
机械破碎法是将白色念珠菌细胞用高压破碎机或超声波处理器等工具进行细胞破碎，然后通过差速离心等技术将原生质体分离出来。
酵素消化法则是将白色念珠菌细胞暴露在含有特定酶的缓冲液中，使细胞壁和膜受到酵素的消化，最终得到原生质体。
在制备过程中，需要注意的是选择合适的菌株和培养条件，以及保持操作的无菌性和温度控制等方面。
制备出的原生质体可以用于基因转化、蛋白表达和酶学分析等方面的研究。
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真菌菌悬液的制备
真菌菌悬液的制备1）白色念珠菌悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。
取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。
用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。
挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第 3 代培养物。
2）取第3代～14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。
3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。
4）菌悬液保存在4℃冰箱内备用。
当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
菌落形态可直接用显微镜观察。
菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。
1) 在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。
取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。
用接种环划线接种第 1 代培养物于MEA 培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h。
取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h，即为第3代培养物。
2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置30℃±1℃培养42h～48h。
钴60辐照灭菌生物指标菌(白色念珠菌)使用SOP
1．目的：建立钴60辐照灭菌生物指标菌——白色念珠菌CMCC（F）98 001的使用规程，保证正确使用，对钴60辐照灭菌效果进行验证。
2．适用范围：适用于用钴60辐照灭菌生物指标菌——白色念珠菌CMCC（F）98 001对钴60辐照灭菌效果进行的监测。
3．职责：钴60辐照灭菌操作人员、QA人员、QC微生物检验员对本标准的实施负责。
4．方法：4.1白色念珠菌作为供试品无菌检查的真菌对照菌。
4.2 培养基的制备4.2.1营养肉汤培养基胨 10.0g，氯化钠 5.0g，牛肉浸出粉 3.0g，水 1000mL。
取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装，灭菌。
4.2.2 营养琼脂培养基按上述4.2.1营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH使灭菌后为7.2±0.2,分装，灭菌。
4.2.3 硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）酪胨（胰酶水解） 15.0g，氯化钠 2.5g，葡萄糖 5.0g，新配制的0.1%刃天青溶液1.0mL,硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸 0.3mL） 0.5g，L-胱氨酸 0.5g，琼脂 0.75g，酵母浸出粉 5.0g,水 1000mL。
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
4.2.3 改良马丁培养基（用于培养真菌）胨 5.0g，磷酸氢二钾 1.0g，酵母浸出粉身碎骨2.0g，硫酸镁 0.5g，葡萄糖 20.0g，水 1000mL。
白色念珠菌与抑菌效力检查方法
表
类别
产品分类
药品
1 类 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、 制剂、 耳用 制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂 2 类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于 局部给药制剂、 黏膜的乳剂 3类 口服非固体制剂（非抗酸制剂） 口服非固体制剂（非抗酸制剂） 4类 非固体抗酸制剂
抑菌剂效力测定 概述 1、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、 、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、 非灭菌制剂中抑菌剂的活性， 非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终 产品的抑菌效力， 产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产 企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。 企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。 2、如果药物本身不含有充分的抗菌活性， 、如果药物本身不含有充分的抗菌活性， 那么应根据制剂特性（如水溶液制剂） 那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添 加适宜的抑菌剂， 加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常储存 和使用过程中可能发生微生物污染和大量 繁殖尤其多剂量包装的制剂， 繁殖尤其多剂量包装的制剂，避免因药物 微生物污染及对患者造成伤害。 微生物污染及对患者造成伤害。
2、如平板上生长的菌落与上述菌落形态特 、 征相符或疑似，应挑选2～ 个菌落分别接 征相符或疑似，应挑选 ～3个菌落分别接 种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～ 种至念珠菌显色培养基平板上，培养 ～ 48小时（必要时延长至 小时）。若平 小时（ 小时）。 小时 必要时延长至72小时）。若平 板上无绿色或翠绿色的菌落生长， 板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试 品未检出白色念珠菌。 品未检出白色念珠菌。 3、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色， 、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色， 挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温 吐温80 挑取相符或疑似的菌落接种于 吐温 玉米琼脂培养基上，培养24～ 小时 小时。 玉米琼脂培养基上，培养 ～48小时。 取培养物进行染色，镜检及芽管试验。 取培养物进行染色，镜检及芽管试验。
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌是一种常见的真菌，对人类健康产生了重要的影响。
为了研究白色念珠菌的基因组，需要制备白色念珠菌的原生质体。
本文介绍了一种简单有效的制备白色念珠菌原生质体的方法。
首先，采集白色念珠菌的新鲜菌丝，放入含有0.7 mol/L山梨酸钾(pH 5.5)的离心管中。
将离心管放入液氮中冷冻10 min，然后在37℃水浴中加热2 min。
重复以上步骤3次，然后将离心管转移到冰上。
接下来，用20%聚乙二醇4000(pH 8.0)缓慢滴加到离心管中，轻轻摇动2 min，然后离心10 min(12000 rpm)。
将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积的丙酮，混合均匀后离心10 min(12000 rpm)。
将上清丢弃，沉淀用干燥的滤纸吸干，即为制备好的白色念珠菌原生质体。
通过上述方法制备的白色念珠菌原生质体可以用于进一步的基
因克隆、基因转染等实验。
这种方法操作简单，成本低廉，适用于实验室中大规模制备原生质体。
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白色念珠菌菌液制备
白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～28小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu 的孢子悬浮液。
黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬液。
供试液的制备无抑菌活性的供试品供试液的制备稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）固体、半固体、粘稠性供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。
具有抑菌活性的供试品试液的制备当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。
每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。
计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。
控制菌检查时可加大增菌液的用量。
离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗吗，按薄膜过滤法测定其菌落数。
中和法：选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。
菌液组：测定所加的试验菌数。
采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
菌液制备标准操作规程
一、目的：建立方法适用性检查用菌、阳性对照菌及验证用菌的制备及使用标准操作规程，为操作人员提供正确的操作规程。
二、范围：使用于供试品无菌检查及方法适用性试验，微生物限度检查及方法适用性试验，培养基适用性检查等所用菌液的制备。
三、职责：微生物实验室人员。
四、内容：1、简述:1.1、试验环境：应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内或生物安全柜中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
1.2、操作室的清洁与消毒应依照《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。
2、设备及仪器:2.1、阳性对照室2.2、生化培养箱2.3、压力蒸汽灭菌器2.4、微波炉2.5、玻璃器皿:锥形瓶、培养皿（90mm）、试管及塞、刻度吸管（0.1ml、1ml、5ml、10ml）锥形瓶等用前应洗涤干净。
刻度吸管口上端距0.5㎝处塞约2㎝的适宜疏松棉花，灭菌备用。
2.6、用具:接种环（铂金或镍铬合金，环径4～5㎜、长度6～10㎝）3、试液：3.1、消毒液: 0.1%苯扎溴铵溶液、0.1%醋酸氯已定溶液、CLBⅡ型消毒溶液（规格：0.65g/片）、75%乙醇溶液、杀孢子剂。
消毒液配制按《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。
3.2、试验用液: 0.9％无菌氯化钠溶液、PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。
试验用液配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。
4、培养基: 胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基。
培养基配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。
5、菌种：所用的菌种传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代,一般使用2～5代的菌种），具体如下：金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕大肠埃希菌〔CMCC（B）44 102〕铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50 094〕生孢梭菌〔CMCC（B）64 941〕枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕6、菌液制备:接种金黄色葡萄球菌、铜绿假胞单菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物至胰酪大豆胨液体培养基中；接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养24～72小时，观察上述培养物如生长良好，无菌分装约3ml/管（生孢梭菌上层加约1ml液状石蜡隔绝空气，造成厌氧环境），并取1管（其余至4～6℃冰箱冷藏保存，铜绿假胞单菌室温保存，在有效期内使用）用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液，采用10倍级系列稀释法制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌的原生质体制备可以通过以下步骤实现：
1. 准备白色念珠菌的培养物，并在对数生长期收集细胞。
通常选择光密度（OD）为0.6至1之间的培养物。
2. 将细胞离心，并用冷洗涤缓冲液（例如10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，0.5M蔗糖）悬浮。
3. 加入蛋白酶抑制剂（例如PMSF），并在冰上振荡30分钟以使细胞壁破裂。
4. 转移混合物到新离心管中，并在低速离心下离心10分钟以除去残留的细胞碎片和细胞核。
5. 将上清液转移到高速离心管中，并在12,000×g的离心下离心20分钟，沉淀出原生质体。
6. 将原生质体沉淀重悬于适当的缓冲液中（例如10mM Tris-HCl pH
7.5，1mM EDTA）。
这些步骤将使您能够制备白色念珠菌的原生质体，供进一步实验使用。
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白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～28小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu 的孢子悬浮液。
黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬液。
供试液的制备无抑菌活性的供试品供试液的制备稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）固体、半固体、粘稠性供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。
具有抑菌活性的供试品试液的制备当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。
每试液所注的平皿生长的菌1ml供数之和即为1ml的菌落数。
计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。
控制菌检查时可加大增菌液的用量。
离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌约500液2ml，加稀释液补至原量。
薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗薄膜过滤法测定其菌落数。
按，吗中和法：选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。
菌液组：测定所加的试验菌数。
．采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备个平皿，按平皿法测定其菌落数。
1.5试验组平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
1.5.2培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中，每个平皿再注入50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平均制备2．个平皿，按平皿法测定其菌落数。
1.5.3薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。
至少要一张膜。
1.5.4离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，试供如液多含许药渣，先以500转/分钟离心3～5．分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，1ml液体，并用稀释剂洗地管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
1.6供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）稀释剂对照组若供试剂需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法额、等处理时，应增加稀释剂对照组。
．用稀释剂代替供试品，加入试验菌。
最终浓度为每1ml供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和技术方法计算。
回收率计算试验组回收率计算试验组的菌回收率=菌液组的平供试品对照组平均菌落验组的菌回收率100% 菌落数数均稀释剂对照组回收率计算试验组的菌回收率=菌液组的平均菌落数数稀释剂对照组平均菌落×100%计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
1.9.在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落≥）分的百率的液组品均菌落数占均照供数减去试品对组的平菌落数菌70%，应采用自用这离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使释法、然沉降法、培养基稀些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，是试验组菌回收率大于70%控制菌检验方法与验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查方法测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检．验结果时，检验方法应进行重新验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
验证用菌株菌株菌株，验证用绿假单胞菌为门菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙、铜代。
传代次数不得超过5乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、小时；分别18～2435～37℃培养10ml的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，10-倍递增稀释法，稀释至无菌氯化钠溶液，采用10取培养液1ml加0.9%的菌悬液。
～100cfu含菌数105～10-7，制成每1ml阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。
希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采方法同试验组，验证大肠埃用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查方法时的阴出。
试验组性对照菌采用大肠埃希菌。
阴性对照菌不得检胆盐乳糖m l1001g常规法大肠埃希菌：取相当于或1ml供试品的供试液至10～希菌肠加入大埃组对性培养基中，阳菌照100cf菌球照加入金黄色葡萄阴性菌对～10100cfu，35～37℃培养18～24小时，取此培养物按《微生物限度检测标准操作规程》大肠埃希菌项下规定检查。
2.4.1.2大肠菌群：取含适量（不少于10ml）的胆盐乳酸发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g或1ml、0.1g或0.1ml、含供试品0.001g或．0.001ml的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照计入近换色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，按《微生物限度检测标准操作规程》大肠菌群项下规定检查。
2.4.1.3沙门菌：取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用均浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加沙门菌10～100cfu，阴性菌对照加入近换色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。
按《微生物湖南金旺稀贵药业有限公司．GMP管理文件．限度检测标准操作规程》沙门菌项下规定检查。
2.4.1.4铜绿假单胞菌：取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu35～37℃培养18．～24小时。
按《微生物限度检测标准操作规程》沙门菌项下规定检查。
2.4.1.5金黄色葡萄球菌：取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu35～37℃培养18～24小时。
按《微生物限度检测标准操作规程》金黄色葡萄球菌项下规定检查。
2.4.2培养基稀释法：供试品有抑菌作用，放大培养基量由1：100放大到1：300、1：500或1．：1000，由于容器提及限制，一般放大到500ml或1000ml，本法适用于抑菌作用不签的样品。
2.4.3薄膜过滤法：采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，试，洗冲，滤过验加菌应在最后一次冲洗液中，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟取下面液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养，本法适用于中等抑菌作用的样品。
．2.4.4中和法：在供试品溶液中加入相应的中和剂一减除供试品中抑菌成份的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成份结合后的产物应对微生物无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。
2.5结果判断至少进行3次独立平行试验。
阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。
若试验组检出试验菌，按照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
3.验证的实施3.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法验证记录及控制菌检验方法验证记录（见附录）。
3.2分析数据，综合整个验证过程，得出验证结论。
3.3验证过程中发生的异常情况，按照《偏差处理程序》进行处理。
4.在验证4.1验证时的检验条件爱你发生改变可能影响检验结果时。
5.附录。