基因敲除方法专题-郭共56页文档
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
ห้องสมุดไป่ตู้
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
基因敲除技术
• 细菌转化方法：CaCl2法和电刺激法
2019/2/17
19
1） CaCl2法
原理：大肠杆菌在低温（0 ℃ ）预处理
的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜透性改变，
易与外源DNA粘附并在细胞表面形成复合物。
然后42℃热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。
将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选
阳性克隆。
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector)
为 使 插 入的外源 DNA 序列可 转录 翻 译 成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
2019/2/17 14
载体的选择标准
能自主复制；
具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和 鉴定；
有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一 酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
2019/2/17
7
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
限制酶消化
开环载体DNA
连接酶
目的基因
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
2019/2/17
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
8
5重组DNA技术的意义
重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制， 从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。
原理: 应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代 靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
基因敲除的表示方法
基因敲除的表示方法一、基因敲除的基本概念。
1.1 基因敲除就像是在基因这个大团队里，精准地开除某个成员。
我们知道，基因就像生命的密码本，里面的每个基因都有自己的任务。
基因敲除呢，就是通过技术手段，让某个特定的基因失去功能。
这就好比一个足球队里，把某个位置上的球员弄下场，不让他发挥作用了，然后看看球队整体表现会发生什么变化。
1.2 这可不是一件简单的事儿。
就像拆钟表，你得小心翼翼地找到那个你想拿掉的小零件，还不能把整个钟表弄坏了。
在基因敲除里，科学家们要利用各种高科技手段，准确地定位到那个要敲除的基因，然后用特殊的方法让它失效。
这有点像孙悟空钻进铁扇公主肚子里，要精准地找到病灶然后解决问题。
2.1 符号表示法。
这就像给每个基因都编了个独特的代号。
比如说，我们用特定的字母组合或者符号来代表某个基因。
当这个基因被敲除了，就会在这个代号上做个特殊标记。
这就好比在球员的名字旁边画个叉，表示他被淘汰出局了。
这种表示方法简单直接，大家一看就明白哪个基因被敲除了。
2.2 图表表示法。
这可是个很直观的方式。
就像画地图一样，把基因的结构画出来，然后用不同的颜色或者标记来表示哪个部分被敲除了。
这就像在一幅城市地图上，把被拆除的建筑物用阴影表示出来，让人一眼就能看清楚哪里发生了变化。
科学家们通过这种图表，可以很清楚地给同行或者学生讲解基因敲除的情况，这就叫“一图胜千言”啊。
2.3 文字描述法。
有时候，简单的文字也能把基因敲除的情况说得明明白白。
就像讲故事一样，把基因的名字、位置，还有敲除的过程和结果，用通俗易懂的文字写出来。
这就像我们平时给朋友描述一件事情，娓娓道来。
不过这也需要一定的技巧，得把复杂的科学内容转化成大家都能理解的话，不能“茶壶里煮饺子——有货倒不出”。
三、基因敲除表示方法的重要性。
3.1 便于交流。
在科学研究这个大圈子里，世界各地的科学家都在做基因敲除的研究。
如果没有统一的或者大家都能理解的表示方法，那就像鸡同鸭讲，谁也不知道对方在说什么。
基因敲除技术
基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
自学自讲(基因敲除)
Your site here
治疗措施研究方面的应用
急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除, 用 此方法培育的动物的器官可以移植到人体而无 排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因 敲除猪, 且已经开展了将该基因敲除猪的心脏 移植至狒狒体内的实验,经移植后的狒狒存活了 2 -6 个月( 均值为 78天),且均未出现超急性排斥 反应的表现。
gene double knockout mice[ J] . FASEB J. 1999, 13( 6): 667-75.
Your site here
参考文献
[ 5 ] Leheste JR, Melsen F , Wellner M, et al.Hypocalcemia and osteopathy in mice with kidney-specific megalin gene defect[ J] .
Your site here
免疫学方面的应用
近年来,在免疫学方面出现了几十种免疫分子 基因敲除动物模型, 将免疫学研究特别是免疫 耐受的研究推到一个新的阶段 。例如: TCR 基 因敲除后 ,小鼠胸腺发育不全, 脾中 B 细胞增多 ; 免疫球蛋白 u链基因被敲除后 ,B 细胞发育受 阻 ; MHC I 和 II 类抗原基因敲除后, 小鼠缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 细胞; β2
insights on the pathogenesis of ocular albinism type 1[ J] .Hum Mol
Genet . 2000, 9( 19): 2781-2788. [ 4] Witting PK, Pettersson K, Ostlund-Lindqvist AM , et al.Inhibition by a coantioxidant of aortic lipoprotein lipid peroxidation and atherosclerosis in apolipoprotein E and low density lipoprotein receptor
基因敲除技术
．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞<ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1>：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等>的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射>导入同源的胚胎干细胞(ES cell>中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除专题
实现基因敲除的多种原理和方法:
2构建基因敲除动物模型的基本步骤 2.1.2 条件性基因敲除法 2.1.3 诱导性基因敲除法 2.1.4 同源重组基因敲除缺点 2.2 利用随机插入突变进行基因敲除 2.2.1 基因捕获法 2.2.2 基因捕获法的优缺点 2.3 RNAi引起的基因敲除 2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 2.3.2 RNAi基因敲除的优缺点 2.4 实现基因敲除的其他原理 除上述几种已经比较成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，还有一些基于其他原 理的敲除技术正处于研究和完善过程中，如TFOs（Triple helix forming oligonucleotides）引导的基因敲除术以及反义技术在基因敲除技术中的运用等。
需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白
2.2.1 基因捕获法
基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的 新型方法，其原理可见下图。通常基因捕获载体还包括一个无启 动子的报道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 细胞染色 体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可 以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来，从理论上讲， 在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。中靶基 因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析 来获得。
马丁·埃文斯的胚胎干细胞研究对于基因敲除技术具有重要意义 66岁
小故事：
1981年，马丁·埃文斯领导的研究小组从小鼠的胚胎中提取到了胚胎干细胞，将这 种细胞经过培养，再植入小鼠囊胚内，小鼠长成后就成为一个嵌合体：有一些细胞 是原先胚胎分裂而来的，而另一部分则由植入的胚胎干细胞分化而来。 卡佩奇和史密西斯很快意识到了这一技术对于他们工作的意义：用同源重组对胚胎 干细胞中的基因加以改造，再将这种细胞植入动物体内，经分化以后，整个动物体 内就“嵌合”了这种特别的细胞。若运气好，还能得到基因被改造过的生殖细胞， 通过两代繁殖，就能孕育出纯合体的基因修饰小鼠。 他俩各自开展工作，1989年，卡佩奇发表了一篇里程碑式的论文，第一只通过胚胎 干细胞同源重组获得的基因敲除小鼠出现了。 至此，基因靶向技术真正成熟。
基因敲除技术
基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除方法专题-郭..55页PPT
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因？
Ø为什么要研究基因？
Ø如何研究？
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆： 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
基因敲除的方法就这么些，2分48秒看清楚
基因敲除的方法就这么些，2分48秒看清楚现在的基因组编辑工具本身并不能改变基因序列的排布。
它们能做的只是在基因组序列上制造几个缺口。
而真正改变基因组序列，编辑基因组序列的是细胞本身。
而我们能做的，是最大限度地诱导细胞按照我们的意愿完成基因组编辑。
那么，到底是怎么个诱导方式呢？咱们从基因敲除说起~上视频~不愿意看视频的同学也可以看后面的文本哦~如果我们要进行基因敲除。
最简单但也最放任自流的方式是，在我们需要敲除的基因片段上制造一个切口，让细胞自行进行修补。
这个过程中，细胞有可能在缺口上缺失几个碱基，插入几个碱基。
如果缺失或插入的碱基不是3的倍数，这个基因就有可能因为移码突变而出现功能缺失，从而实现敲除。
我们从这些经过处理的细胞中随机挑选出一些，分别进行单个细胞的培养和扩增。
这些由单个细胞扩增形成的细胞群落被称作一个单克隆。
用western、PCR等方法分析这些单克隆的基因表达情况，就可以找到那些目的基因被敲除的细胞群落，也就是我们需要构造的基因敲除单克隆细胞系。
这些单克隆细胞系的目的基因功能被缺失掉了，但是编码基因的序列仍然被留在基因组里，只不过被破坏了，无法正常表达。
另外一个更可控的方式是我们在这个基因序列距离较远的两个位点上分别制造一个切口，两个切口间的大片段极有可能因此被删除。
我们可以筛选出这些发生大片段删除的单克隆。
它们的目的基因几乎可以从基因组中完全删除。
但是这种方法需要挑更多的单克隆进行验证，因为两个位点同时被切割的概率比单位点被切割的概率更低。
前面讲的这两种方法都需要随机挑取单克隆进行验证。
这个有点靠运气。
有一个办法可以让我们的单克隆挑选更有目的性，那就是给咱们被编辑细胞加标记。
比如gfp荧光蛋白？抗性基因等等，在它们的两边加上目的基因序列的同源臂做成标签序列。
把它们放进细胞的同时，也放进去一些基因组编辑工具，在目的序列上制造缺口，增加同源重组的概率，把这些标签给整合进去目的基因序列里。
基因敲除实验原理
基因敲除实验原理基因敲除，听起来是不是超级酷？就像是在基因的世界里当一个小小的“建筑师”，把某个我们不想要的“小零件”给去掉呢。
咱先说说基因是啥吧。
基因就像是生物体内的一本超级复杂的“说明书”，里面写满了各种各样的指令。
这些指令告诉细胞该怎么生长、怎么工作、怎么和其他细胞打交道。
每个基因都有自己的任务，就像一个大家庭里的每个成员都有自己的活儿要干。
那基因敲除呢，简单来说，就是想办法让这个基因“罢工”。
怎么让它罢工呢？这就用到了一些很巧妙的方法。
有一种常见的方法就像是“狸猫换太子”。
科学家们会构建一个特殊的DNA片段。
这个片段呀，和我们想要敲除的基因长得很像，但是又有点不一样。
这个特殊的DNA片段就像是一个“冒牌货”。
然后呢，细胞里面的一些机制就会被这个“冒牌货”给骗了。
细胞会以为这个“冒牌货”就是它原本的那个基因，然后就会发生一些神奇的事情。
这个“冒牌货”会和细胞里面的一些酶呀之类的东西相互作用，最后导致原本的那个基因被破坏掉，就像把一个精密仪器里面的一个关键小零件给弄坏了一样，这个基因就没办法正常工作啦。
还有一种方法呢，就像是给基因使个“绊子”。
科学家们会利用一些特殊的技术，比如说像CRISPR - Cas9系统。
这个系统就像是一个超级精准的“小剪刀”。
这个“小剪刀”可以在基因的特定位置上进行切割。
就像你拿着一把剪刀，准确地把一根绳子在你想要的地方剪断一样。
当这个基因被剪断之后呢，细胞自身会尝试去修复这个断裂的地方。
但是呀，在修复的过程中，就很容易出错，这样就会导致这个基因失去它原本的功能。
这就好比你把一个拼图的一块给剪掉了，然后再胡乱地拼回去，那这个拼图肯定就不完整，也没办法像原来那样好看和有用啦。
那为啥要做基因敲除实验呢？这里面的学问可大着呢。
比如说，我们想知道某个基因是不是和某种疾病有关系。
如果我们把这个基因敲除之后，发现生物出现了和这种疾病类似的症状，那我们就可以初步判断这个基因和这种疾病是有关联的。