基因工程原理
基因工程基本工作原理
基因工程基本工作原理
基因工程是一种通过改变生物体的基因来改变其性状和功能的技术。
基本工作原理包括以下几个步骤：
1. 选取目标基因：确定想要改变的性状或功能，并找到与其相关的基因序列。
2. 获得DNA序列：获取包含目标基因的DNA序列，可以通
过从细胞中分离DNA或使用现有的DNA库等方法来获得。
3. 基因克隆：将目标基因的DNA序列插入到一个DNA载体（如质粒）中。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细胞中自
我复制。
4. DNA转化：将载有目标基因的质粒导入细胞中。
这可以通
过多种方法实现，例如化学处理、电穿孔或使用病毒载体等。
5. 基因整合：目标基因被细胞摄取后，可以将其整合到细胞的染色体中。
这个过程中，目标基因会与宿主DNA进行互补配对，并与染色体连接成一条连续的DNA链。
6. 表达和转录：一旦目标基因被整合到细胞的染色体中，细胞可以开始利用这个基因来合成特定的蛋白质。
这个过程涉及到基因的转录（将DNA转录成RNA）和翻译（将RNA转化为
蛋白质）。
通过以上步骤，基因工程可以实现对生物体基因的改造和定制，
从而赋予其新的性状和功能。
这项技术在农业、医学、工业等领域有着广泛的应用，例如改良作物、生产药物和生物材料等。
基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程是通过改变生物体的基因组来实现对其性状的调控的技术。
其基本原理包括以下几个步骤：
1. 基因选择：从目标生物体中选择具有所需性状的基因。
2. 基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来，通常通过
PCR等方法进行基因扩增。
3. 基因构建：将目标基因插入到载体DNA中，构建重组DNA。
载体可以是细菌、酵母或其他生物的染色体片段，一
般被称为质粒。
4. 基因转导：将重组DNA导入到宿主生物体中。
这通常使用
基因枪、电穿孔和细菌介导等技术来实现。
5. 检验与筛选：对转导后的宿主生物进行筛选，确认目标基因达到预期效果。
这可能需要对基因表达进行检测，例如通过PCR、基因表达测定等方法。
6. 基因表达：在宿主生物中，目标基因会被表达为蛋白质，进而影响其性状。
这可能需要使用特定的启动子、RBS和终止
子等元件来调控基因表达水平。
基因工程的基本原理就是通过这些步骤来实现对基因组的改造，从而达到人为调控生物性状的目的。
这项技术在农业、医学和
生物工程等领域有广泛应用，例如改良植物品种、生产特定药物和生物材料等。
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程基本原理：一个完整的基因克隆过程应包括：目的基因的获取，克隆基因载体的选择与改造，目的基因与载体的连接，重组DNA分
子导入受体细胞，筛选出含感兴趣基因的重组DNA转化细胞。
实现上述
过程需要一些重要的工具酶，如限制性内切核酸酶连接酶等。
限制性
内切核酸酶是一类识别DNA特意序列的内切核酸酶。
①目的基因的获取：
外源基因又称目的基因，来源于几种途径：化学合成、酶促合成c DNA，制备的基因组DNA及PCR技术。
细菌质粒、噬菌体和一些病毒DNA
均可被改造成基因克隆的载体。
②基因载体的选择与构建：
可作为基因载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA，它
们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。
③外源基因与载体的连接：
连接方式有：黏性末端连接、平端连接和人工接头连接等。
④重组DNA导入宿主细胞：
外源DNA与载体在体外连接成重组DNA分子，需将其导入宿主细胞。
随受体细胞生长、增殖，重组DNA分子得以复制、扩增。
⑤重组体的筛选：
鉴定哪一菌落或嗜菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，即可
得到目的基因的克隆，这一过程即为筛选或选择。
⑥克隆基因的表达：
在原核或真核表达体系中进行表达，获得所需要的蛋白质。
例题（单选）：在分子生物学领域中，分子克隆主要是指：
A.DNA的大量复制
B.DNA的大量剪切
C.RNA的大量复制
D.RNA的大量剪切
E.反转录酶。
基因工程的原理是什么
基因工程的原理是什么基因工程是一种利用生物技术手段对生物体进行基因组的改造和调控的技术，它的原理主要包括基因定位、基因克隆、基因转移和基因表达调控等几个方面。
基因工程的原理是通过对生物体的基因进行精准的编辑和调控，从而实现对生物体性状的改良和优化。
首先，基因工程的原理之一是基因定位。
基因定位是指通过一系列实验手段来确定目标基因在染色体上的具体位置，包括物理定位和遗传定位两种方式。
通过基因定位，科学家们可以准确地找到目标基因，并为后续的基因编辑和调控奠定基础。
其次，基因工程的原理还包括基因克隆。
基因克隆是指将目标基因从一个生物体中复制出来，并将其插入到另一个生物体中的过程。
通过基因克隆，科学家们可以获取大量目标基因的复制体，并进行进一步的研究和应用。
另外，基因工程的原理还涉及基因转移。
基因转移是指将目标基因从一个生物体转移到另一个生物体中的过程，可以是同种生物体之间的基因转移，也可以是跨种生物体之间的基因转移。
通过基因转移，科学家们可以实现对生物体基因组的改造和调控，从而获得具有特定性状的生物体。
最后，基因工程的原理还包括基因表达调控。
基因表达调控是指通过一系列的调控机制来控制目标基因的表达水平和表达时机，从而实现对生物体性状的精准调控。
通过基因表达调控，科学家们可以实现对生物体特定性状的增强或抑制，为农业、医药等领域的应用提供了可能。
综上所述，基因工程的原理主要包括基因定位、基因克隆、基因转移和基因表达调控等几个方面。
通过这些原理的应用，基因工程技术可以实现对生物体基因组的精准编辑和调控，为人类社会的发展和进步带来了巨大的潜力和可能性。
基因工程原理
基因工程原理
基因工程是通过改变生物体的遗传信息，以实现特定的生物表型改良或产生特定的有用产物。
其原理主要涉及以下三个方面：
1. 基因克隆：通过利用DNA序列的一组特定酶和载体，将感
兴趣的基因从一个生物体中提取出来，并插入到另一个生物体的染色体上。
这样可以将某个有用基因转移到目标生物体中，并使其具备原生物体所不具备的特性。
2. 基因编辑：利用CRISPR-Cas9等工具，直接在生物体的基
因组中对特定的基因进行精确编辑或修复。
这种方法可以用来纠正基因中的突变、删除不需要的片段或添加新的基因片段，从而改变生物体的性状。
3. 基因调控：通过改变基因的表达调控方式，可以影响基因的表达水平和细胞内的代谢途径。
这可以通过调节转录因子、使用RNA干扰技术、利用人工设计的启动子等方法来实现。
基
因调控的改变可以使生物体在不同环境下表现出不同的性状或产生特定的物质。
通过这些原理，基因工程技术已经被应用于医学、农业、工业等领域，例如生产人类用药、改良农作物抗病性和提高产量、生产环境友好型的工业原料等。
这些应用使得我们能够更好地满足人类的需求，并为经济和社会的可持续发展做出贡献。
基因工程技术与应用知识点
基因工程技术与应用知识点
1.基因工程技术的原理
基因克隆是指将感兴趣的基因从一个物种中剪切并插入到另一个物种
的DNA中。
首先，需要获得目标基因的DNA序列，然后通过PCR扩增得到
足够多的目标基因的DNA片段。
接下来，将目标基因的DNA片段与质粒进
行连接，形成重组质粒。
最后，将重组质粒导入宿主细胞中，使其进行复
制和表达。
这样，目标基因就被克隆到宿主细胞的基因组中。
转基因是指利用基因工程技术将外源基因导入目标细胞中，使其产生
新的功能或性状。
转基因主要通过两种方法实现：直接注射外源基因或利
用载体导入外源基因。
直接注射外源基因常用于转基因动物的制作，而利
用载体导入外源基因则常用于转基因植物的制作。
通过转基因技术，可以
实现农作物的抗虫、抗病、抗逆性增强，以及工业酶的大规模生产等。
2.基因工程技术的应用
农业领域：基因工程技术可以用于农作物的抗虫、抗病和抗逆性提高
等方面。
通过转基因技术，可以使植物表达抗虫蛋白，减少对农药的依赖；也可以导入外源基因，增强植物的抗逆性，使其在恶劣环境下仍能正常生长。
工业领域：基因工程技术可以用于工业酶的生产，如乳酸菌发酵生产
乳酸。
此外，基因工程还可以用于生物燃料的生产，如利用转基因酵母生
产乙醇。
基因工程的原理是什么
基因工程的原理是什么
基因工程是一种利用生物技术手段对生物体进行基因改造的技术，它的原理主要包括基因分离、基因修饰和基因重组三个方面。
基因工程的原理是通过对生物体的基因进行改造，实现对生物体性状的调控和改良，从而达到人为控制生物体遗传特征的目的。
首先，基因工程的原理之一是基因分离。
基因是生物体内控制遗传信息传递和表现的基本单位，通过基因分离技术，可以将特定的基因从一个生物体中分离出来。
这一过程需要利用分子生物学技术，如PCR、酶切等，将目标基因从细胞或DNA中分离出来，为后续的基因修饰和重组奠定基础。
其次，基因工程的原理还包括基因修饰。
基因修饰是指对已分离的基因进行改造，使其具有特定的性状或功能。
这包括基因的点突变、插入、删除等操作，通过改变基因的序列，使其表达产生不同的蛋白质或调控特定的生物过程，从而实现对生物体性状的调控和改良。
最后，基因工程的原理还涉及基因重组。
基因重组是指将不同来源的基因进行组合，形成新的基因组合，使生物体表现出新的性
状或功能。
通过基因重组技术，可以将来自不同生物体的基因进行组合，形成转基因生物，从而实现对生物体性状的改造和调控。
总的来说，基因工程的原理是通过基因分离、基因修饰和基因重组等技术手段，对生物体的基因进行改造，实现对生物体性状的调控和改良。
基因工程技术的应用，不仅可以用于农业领域的作物育种和畜禽改良，还可以用于医学领域的基因治疗和药物研发，对人类健康和生物资源的可持续利用具有重要意义。
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– 启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、 T7噬菌体启动子 – 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始 密码子(ATG)和SD序列 – 转录终止序列
• 3′→5′外切酶活性 • 5′→3′外切酶活性
3′→5′外切酶活性 5′ 3 ′
3′ 5′
5′→3′外切酶活性
末端脱氧核 苷酰转移酶 (TDT)
载体 vector
• DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和 表达 • 克隆载体、表达载体
– 原核载体：质粒(pBR322,pUC…） 噬菌体（λ，M13）等 – 真核载体：动物病毒载体pLXSN等
哺乳动物表达载体
• 真核表达元件：启动子/增强子—克隆位 点—终止信号和加poly(A)信号
重组DNA技术的基本过程
• • • • • 目的基因的制备 载体的选择和制备 DNA分子的体外连接 将外源DNA导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定
目的基因(target DNA)的制备
• 目的基因（外源基因） • 制备基因组DNA
• • • • • 工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 真核细胞转染 克隆基因的表达
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
cDNA合成
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
Eco RⅠ
Hind Ⅲ Bam HⅠ S al Ⅰ
氨苄青霉素 抗性基因
(ampr)
Pst Ⅰ
pBR322
四 环 素 (terr) 抗性基因
Ava Ⅰ
Ori
Pvu Ⅱ
常用的克隆载体
• λ噬菌体(λphage)
– 基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、 右侧区 – DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb – 常用：EMBL 系列、 λgt 系列、charon系列
* 胰岛素 * 人生长激素 * 干扰素 * 白细胞介素2 * 粒细胞集落刺激因子 * 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 * 红细胞生成素 EPO * 组织纤溶酶原激活剂 * 生长激素 * 促生长素 * 抗血友病因子Ⅷ * 脱氧核糖核酸酶 * 葡糖脑苷脂酶 * 鼠单克隆抗体
自然界的基因转移和重组
• 基因重组(genetic recombination)——整 段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种 间进行交换,并能在新的位置上复制,转录 和翻译 • 自然界的基因转移和重组是无目的 • 基因工程有目的
整合 细胞内复制
•
•
载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质 粒、 pUC系列、M13噬菌体 DNA分子的体外连接（DNA连接酶）
–
*
粘性末端连接 连接效率高
相同酶切末端
– – –
平端连接 连接效率低 人工接头(linker)法 同聚物接尾法
同聚物接尾法
载体DNA 3′ PolyG +dGTP 3′ 3′ 目的基因 +dCTP 3′ PolyC
• 1993 基因工程西红柿在美国上市 • 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 • 1999.9 中国获准加入人类基因组计划. 负责测定人类基因组全部序列的1% • 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作 草图 • 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 • 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、 酶工程bp
—1534
— 994 — 695
— 515 — 377 — 237
克隆基因的表达
• 载体有转录、翻译的元件； 密码子通用
• 原核表达体系
– 原核表达载体的标准
* 合适的筛选标志 * 强启动子 * 翻译控制序列 * 多克隆位点
•
融合蛋白（fusion protein,包涵体）
– 表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA 编码，C末断由克隆的真核DNA编目。
• 结合作用
– 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个 细胞（细菌）
• 转化作用 transformation – 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使
细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的 过程
转导作用 transduction
• 病毒、噬菌体介导
– 溶菌途径；溶原菌途径
溶原
裂解
基因工程
常用的克隆载体
• 质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的 小型环状双链DNA分子
– 理想的质粒
* 拷贝数多; * 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素 基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶 基因(lac Z) 筛选标志 * 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)
• 粘性质粒(cosmid)： λDNA的 cos区+质粒，双 链环状DNA，克隆容量：40~50kb • M13噬菌体
– 最大优点：产生单链DNA
特点：
cos:cohesiveend site
RF DNA: replicational form DNA
优点：
表达载体(expressing vector)
缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化 融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性 很难表达大量的可溶性蛋白
•
大肠杆菌表达体系的不足
– – – –
真核表达体系
• 转染方法
– – – – – 磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染；人造膜 显微注射
• 筛选标志 • 瞬时转染 • 稳定转染
第八章 基因工程
• 基因工程 ( genetic engineering)、基因 克隆、DNA重组、 DNA克隆、分子克隆 • 克隆（clone） 无性繁殖
– 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分 子（复制子、重组体），继而通过转化或转 染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA 分子拷贝，或其表达产物。
DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性
• 5′至3′的聚合活性
– 5′→ 3′方向
• 核酸 外切酶活性
– 5′→ 3′外切酶活性 – 3′→ 5′外切酶活性 • pol Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 – 大片段 （Klenow片段）：聚合活性、 3′→ 5′外 切活性 常用的工具酶
核酸外切酶活性
• 基因克隆示意图
载 体 DNA (限 制 性 内 切 酶 切 开 )
＋
目的基因
＋
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表达
基因工程大事记
• 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 • 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上 第一种基因工程蛋白药物 • 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛 素在英、美获准使用 • 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国 转基因鱼
• Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA， DNA测序。
限制性核酸内切酶 (restriction enzyme)
• 识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸 二酯键 • 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 • 命名：
– EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ： 发现次序)
• 识别和切割位点
– 回文结构 4～6 bp
• neor
– 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质 合成 – G418：干扰原核、真核生物 – neo：磷酸转移酶，使G418失活 – neo 与目的基因连锁,转染
目的基因的定点诱变及其应用
• 基因定点诱变技术 • 基因定点诱变技术的应用
– 出现两种末端 *粘性末端 粘端 *平头末端 平端 • 同工异源酶：来源不同，但能识别和切 割同一位点 • 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的 粘性末端
粘性末端与平头末端
EcoRⅠ GAATTC 3′ 3′ CTTAAG 5′
5′ 5′
粘性末端 G 3′ CTTAA AATTC 3′ G 5′
SmaⅠ CCCGGG 3′ GGGCCC
将外源DNA导入宿主细胞
• 基因工程菌 HB101,JM109 • 转化(transformation)
– 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适 摄取和容忍外来DNA的生理状态
• 感染(infaction)
– 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗 传信息转移过程
• 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动 导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
• 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和 切割序列，认为它由5-6个碱基组成 • 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000 碱基的片段。 • 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 • 限制性酶：HindⅡ
3' 5'
C-A-Pu-Py-T-G G-T-Py-Pu-A-C
5' 3'
5′ 3′ 5′ 5′
平头末端 CCC 3′ GGG GGG 3′ CCC 5′
修饰酶
• • • • • DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) • Taq DNA聚合酶