基因工程原理
基因工程基本工作原理
基因工程基本工作原理
基因工程是一种通过改变生物体的基因来改变其性状和功能的技术。
基本工作原理包括以下几个步骤：
1. 选取目标基因：确定想要改变的性状或功能，并找到与其相关的基因序列。
2. 获得DNA序列：获取包含目标基因的DNA序列，可以通
过从细胞中分离DNA或使用现有的DNA库等方法来获得。
3. 基因克隆：将目标基因的DNA序列插入到一个DNA载体（如质粒）中。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细胞中自
我复制。
4. DNA转化：将载有目标基因的质粒导入细胞中。
这可以通
过多种方法实现，例如化学处理、电穿孔或使用病毒载体等。
5. 基因整合：目标基因被细胞摄取后，可以将其整合到细胞的染色体中。
这个过程中，目标基因会与宿主DNA进行互补配对，并与染色体连接成一条连续的DNA链。
6. 表达和转录：一旦目标基因被整合到细胞的染色体中，细胞可以开始利用这个基因来合成特定的蛋白质。
这个过程涉及到基因的转录（将DNA转录成RNA）和翻译（将RNA转化为
蛋白质）。
通过以上步骤，基因工程可以实现对生物体基因的改造和定制，
从而赋予其新的性状和功能。
这项技术在农业、医学、工业等领域有着广泛的应用，例如改良作物、生产药物和生物材料等。
基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程是通过改变生物体的基因组来实现对其性状的调控的技术。
其基本原理包括以下几个步骤：
1. 基因选择：从目标生物体中选择具有所需性状的基因。
2. 基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来，通常通过
PCR等方法进行基因扩增。
3. 基因构建：将目标基因插入到载体DNA中，构建重组DNA。
载体可以是细菌、酵母或其他生物的染色体片段，一
般被称为质粒。
4. 基因转导：将重组DNA导入到宿主生物体中。
这通常使用
基因枪、电穿孔和细菌介导等技术来实现。
5. 检验与筛选：对转导后的宿主生物进行筛选，确认目标基因达到预期效果。
这可能需要对基因表达进行检测，例如通过PCR、基因表达测定等方法。
6. 基因表达：在宿主生物中，目标基因会被表达为蛋白质，进而影响其性状。
这可能需要使用特定的启动子、RBS和终止
子等元件来调控基因表达水平。
基因工程的基本原理就是通过这些步骤来实现对基因组的改造，从而达到人为调控生物性状的目的。
这项技术在农业、医学和
生物工程等领域有广泛应用，例如改良植物品种、生产特定药物和生物材料等。
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程基本原理：一个完整的基因克隆过程应包括：目的基因的获取，克隆基因载体的选择与改造，目的基因与载体的连接，重组DNA分
子导入受体细胞，筛选出含感兴趣基因的重组DNA转化细胞。
实现上述
过程需要一些重要的工具酶，如限制性内切核酸酶连接酶等。
限制性
内切核酸酶是一类识别DNA特意序列的内切核酸酶。
①目的基因的获取：
外源基因又称目的基因，来源于几种途径：化学合成、酶促合成c DNA，制备的基因组DNA及PCR技术。
细菌质粒、噬菌体和一些病毒DNA
均可被改造成基因克隆的载体。
②基因载体的选择与构建：
可作为基因载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA，它
们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。
③外源基因与载体的连接：
连接方式有：黏性末端连接、平端连接和人工接头连接等。
④重组DNA导入宿主细胞：
外源DNA与载体在体外连接成重组DNA分子，需将其导入宿主细胞。
随受体细胞生长、增殖，重组DNA分子得以复制、扩增。
⑤重组体的筛选：
鉴定哪一菌落或嗜菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，即可
得到目的基因的克隆，这一过程即为筛选或选择。
⑥克隆基因的表达：
在原核或真核表达体系中进行表达，获得所需要的蛋白质。
例题（单选）：在分子生物学领域中，分子克隆主要是指：
A.DNA的大量复制
B.DNA的大量剪切
C.RNA的大量复制
D.RNA的大量剪切
E.反转录酶。
基因工程的原理是什么
基因工程的原理是什么基因工程是一种利用生物技术手段对生物体进行基因组的改造和调控的技术，它的原理主要包括基因定位、基因克隆、基因转移和基因表达调控等几个方面。
基因工程的原理是通过对生物体的基因进行精准的编辑和调控，从而实现对生物体性状的改良和优化。
首先，基因工程的原理之一是基因定位。
基因定位是指通过一系列实验手段来确定目标基因在染色体上的具体位置，包括物理定位和遗传定位两种方式。
通过基因定位，科学家们可以准确地找到目标基因，并为后续的基因编辑和调控奠定基础。
其次，基因工程的原理还包括基因克隆。
基因克隆是指将目标基因从一个生物体中复制出来，并将其插入到另一个生物体中的过程。
通过基因克隆，科学家们可以获取大量目标基因的复制体，并进行进一步的研究和应用。
另外，基因工程的原理还涉及基因转移。
基因转移是指将目标基因从一个生物体转移到另一个生物体中的过程，可以是同种生物体之间的基因转移，也可以是跨种生物体之间的基因转移。
通过基因转移，科学家们可以实现对生物体基因组的改造和调控，从而获得具有特定性状的生物体。
最后，基因工程的原理还包括基因表达调控。
基因表达调控是指通过一系列的调控机制来控制目标基因的表达水平和表达时机，从而实现对生物体性状的精准调控。
通过基因表达调控，科学家们可以实现对生物体特定性状的增强或抑制，为农业、医药等领域的应用提供了可能。
综上所述，基因工程的原理主要包括基因定位、基因克隆、基因转移和基因表达调控等几个方面。
通过这些原理的应用，基因工程技术可以实现对生物体基因组的精准编辑和调控，为人类社会的发展和进步带来了巨大的潜力和可能性。
基因工程原理
基因工程原理
基因工程是通过改变生物体的遗传信息，以实现特定的生物表型改良或产生特定的有用产物。
其原理主要涉及以下三个方面：
1. 基因克隆：通过利用DNA序列的一组特定酶和载体，将感
兴趣的基因从一个生物体中提取出来，并插入到另一个生物体的染色体上。
这样可以将某个有用基因转移到目标生物体中，并使其具备原生物体所不具备的特性。
2. 基因编辑：利用CRISPR-Cas9等工具，直接在生物体的基
因组中对特定的基因进行精确编辑或修复。
这种方法可以用来纠正基因中的突变、删除不需要的片段或添加新的基因片段，从而改变生物体的性状。
3. 基因调控：通过改变基因的表达调控方式，可以影响基因的表达水平和细胞内的代谢途径。
这可以通过调节转录因子、使用RNA干扰技术、利用人工设计的启动子等方法来实现。
基
因调控的改变可以使生物体在不同环境下表现出不同的性状或产生特定的物质。
通过这些原理，基因工程技术已经被应用于医学、农业、工业等领域，例如生产人类用药、改良农作物抗病性和提高产量、生产环境友好型的工业原料等。
这些应用使得我们能够更好地满足人类的需求，并为经济和社会的可持续发展做出贡献。
基因工程概念
基因工程概念一、前言基因工程是近年来科学技术发展的重要成果之一，它在生物学、医学、农业等领域都有着广泛的应用。
本文将从基因工程的定义、历史、技术原理、应用领域等方面进行详细介绍。
二、基因工程的定义基因工程是指利用现代生物技术手段对生物体中的基因进行人为改造和调控，以达到预期目的的一种技术。
它可以通过改变DNA序列，实现对生物体内部结构和功能的调整和修复。
三、基因工程的历史20世纪70年代初期，科学家们开始尝试通过重组DNA技术来改变生物体内部结构和功能。
1972年，保罗·伯格首次成功地将两个不同来源的DNA片段合并成一个新的DNA分子。
这标志着人类进入了基因工程时代。
此后，随着科技水平不断提高，基因工程技术也得到了快速发展。
四、基因工程的技术原理1. DNA分离：从生物体中提取出需要进行改造或调控的DNA片段。
2. DNA剪切：利用限制性内切酶将需要操作的DNA片段剪切成特定的长度和形状。
3. DNA连接：将不同来源的DNA片段通过连接酶进行拼接，并形成新的DNA分子。
4. DNA转染：将新合成的DNA分子送入目标细胞中，使其被细胞吸收并嵌入到细胞核内。
5. DNA复制：通过PCR等技术手段对嵌入到目标细胞中的DNA分子进行复制，以实现基因工程目的。
五、基因工程的应用领域1. 医学领域：基因工程技术可以用于治疗遗传性疾病、癌症等疾病。
例如，利用CRISPR-Cas9技术可以精准地修复人类基因组中存在的错误或缺陷。
2. 农业领域：基因工程技术可以用于改良作物品种、提高农作物产量和抗逆性能。
例如，利用转基因技术可以增强植物对虫害和草害的抵抗力。
3. 工业领域：基因工程技术可以用于生产高效能、低成本、环保型生物制品。
例如，利用酵母菌等微生物进行大规模发酵生产乙醇、乳酸、维生素等化学品和生物制品。
4. 环保领域：基因工程技术可以用于修复环境污染和生态破坏。
例如，利用基因工程技术可以改变植物对重金属的吸收能力，从而达到净化土壤的目的。
基因工程技术与应用知识点
基因工程技术与应用知识点
1.基因工程技术的原理
基因克隆是指将感兴趣的基因从一个物种中剪切并插入到另一个物种
的DNA中。
首先，需要获得目标基因的DNA序列，然后通过PCR扩增得到
足够多的目标基因的DNA片段。
接下来，将目标基因的DNA片段与质粒进
行连接，形成重组质粒。
最后，将重组质粒导入宿主细胞中，使其进行复
制和表达。
这样，目标基因就被克隆到宿主细胞的基因组中。
转基因是指利用基因工程技术将外源基因导入目标细胞中，使其产生
新的功能或性状。
转基因主要通过两种方法实现：直接注射外源基因或利
用载体导入外源基因。
直接注射外源基因常用于转基因动物的制作，而利
用载体导入外源基因则常用于转基因植物的制作。
通过转基因技术，可以
实现农作物的抗虫、抗病、抗逆性增强，以及工业酶的大规模生产等。
2.基因工程技术的应用
农业领域：基因工程技术可以用于农作物的抗虫、抗病和抗逆性提高
等方面。
通过转基因技术，可以使植物表达抗虫蛋白，减少对农药的依赖；也可以导入外源基因，增强植物的抗逆性，使其在恶劣环境下仍能正常生长。
工业领域：基因工程技术可以用于工业酶的生产，如乳酸菌发酵生产
乳酸。
此外，基因工程还可以用于生物燃料的生产，如利用转基因酵母生
产乙醇。
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基因工程原理内容提要1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。
基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。
该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。
3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。
根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。
Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。
第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。
基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。
基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。
平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。
这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。
将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。
7.基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息。
8.DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。
9.重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。
10.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大批生物技术产业。
基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。
基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代。
基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一，基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。
第一节基因工程技术的诞生基因工程又称基因操作(gene manipulation), 重组DNA(recombinant DNA)技术, 是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
一、基因工程技术的诞生1972年，P.. Berg等在PNAS上发表了题为∶“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法: 含有λ噬菌体基因和 E.coli 半乳糖操纵子的环状SV40DNA”，标志着基因工程技术的诞生。
SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450的球形病毒，分子量为28×106道尔顿。
SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对，编码三个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和一个T抗原。
SV40DNA上有一个限制性内切酶E.coRⅠ的切点。
Berg等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状SV40DNA(图3-1)。
图3-1 重组的SV40二聚体的构建(引自 Berg et. al,1972)当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小。
当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。
于是他们进行第二步的实验就是从λdvgal DNA中制备含有 E.coli 的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。
Berg等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一个新时代的到来，为此他获得了1980年诺贝尔化学奖。
二、基因操作的基本过程和特点基因工程的操作可用图3-2表示∶图3-2 基因工程的基本过程(引自Old & Primrose,1980)它所涉及的过程可用“分(合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表示。
分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。
分离制备或合成制备DNA的方法都有很多种。
切∶即在体外将DNA进行切割，使之片段化或线性化。
连∶即在体外将不同来源的DNA分子重新连接起来，构建重组DNA分子。
转∶即将重组连接的DNA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达。
选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定，因为有些重组体并非是所需要的，必需通过分析鉴定。
基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。
基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，构建在生物体内难以进行的重组，然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。
这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。
第二节限制性内切核酸酶外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给DNA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。
基因工程中使用的工具酶很多，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。
基因工程上把那些具有识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。
一、限制性内切核酸酶的发现1952年Luria、Human在T偶数噬菌体、1953年weigle、Bertani在λ 噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。
正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现。
噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力，取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。
例如，将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴定度可差好几个数量级。
第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。
此种现象即为宿主控制的限制作用(host—Controlled restriction)。
用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNA的降解。
如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来，之所以能够如此，乃是通过稍为宿主控制的修饰作用(host-controlled modification)。
因此，限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNA的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制。
修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。
到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restriction—modification system． R-M system)。
该系统中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。
一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。
1968年，Meselson从E．coli K株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从 E．coli B株中分离到限制酶EcoB。
遗憾的是，由于EcoK和EcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。
1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割 DNA，这个酶后来命名为HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的DNA片段就具有特别的意义。
二、限制性内切核酸酶的命名和分类（一）限制性内切核酸酶的命名按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。
由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。
为了避免混淆，1973年Smith 和Nathans对内切酶的命名提出建议，1980年，Roberts对限制性酶的命名进行分类和系统化。
限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 + 种名 + 株名的个一个首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶的命名要点列于表3-1。
表3-1 限制性内切核酸酶的命名要点条目要点基本原则3-4个字母组成, 方式是:属名+种名+株名+序号首字母取属名的第一个字母, 且大写第二字母取种名的第一个字母, 小写第三字母①取种名的第二个字母, 小写; ②若种名有词头, 且已命名过内切酶, 则取词头后的第一字母代替第四字母若有株名, 株名则作为第四字母, 是否大小写, 根据原来的情况而定顺序号若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶, 则按先后顺序冠以I、II、III,.....等如: EcoK: Escherichia coli K (大肠杆菌K株)（二）限制性内切核酸酶的分类限制性内切核酸酶的作用特点，将它们分为三大类。