一种简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法
ipsc分化为rpe的方法
ipsc分化为rpe的方法IPSC分化为RPE的方法简介在干细胞研究领域，将人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，简称iPSC）分化为视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，简称RPE）细胞是一个具有重要意义的研究方向。
RPE细胞在视网膜功能维持中起着重要的作用。
本文将介绍一些常用的方法，用于IPSC分化为RPE细胞。
方法一：原代细胞培养在过去的研究中，研究人员采用了原代细胞培养的方法来分化IPSC为RPE细胞。
这种方法的优点在于可以直接从组织中获得RPE细胞，并且维持了RPE细胞的天然特性。
但是，原代细胞培养方法存在许多挑战，如细胞来源有限、细胞增殖缓慢等。
方法二：向下分化法向下分化法是一种常用的方法，可将IPSC分化为RPE细胞。
该方法利用特定的培养条件和信号通路调控，将IPSC逐步分化为RPE细胞。
这种方法的优点在于可以控制分化过程中的细胞品质和数量，但是也需要精确调控培养条件和信号通路。
单因子向下分化法单因子向下分化法是指通过添加特定的因子或生长因子，来促进IPSC向RPE细胞的分化。
常用的因子包括视黄醇、肝细胞生长因子等。
这些因子的选择和时间控制对分化的效果有重要影响。
多因子向下分化法多因子向下分化法是通过联合使用多个因子，来实现更精确的IPSC向RPE细胞的分化。
这种方法的优点在于可以模拟胚胎发育过程，提高分化效率和细胞品质。
方法三：遗传改造法遗传改造法是通过基因编辑技术，对IPSC进行遗传改造，使其能够直接分化为RPE细胞。
常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN等。
这种方法的优点在于可以直接转录特定的RPE细胞转录因子，从而实现高效的分化。
方法四：重编程法重编程法是将IPSC重新编程为RPE细胞的一种方法。
通过转录因子的表达，在IPSC中激活RPE细胞特定基因的表达，从而实现分化。
该方法的优点在于不需要添加外源性因子，但是需要精确控制转录因子的表达时间和水平。
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。
原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。
原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。
1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。
其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。
其培养方法如下：(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。
(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
鼻黏膜上皮细胞培养路线
鼻黏膜上皮细胞培养路线方法一：分离细胞培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织进行冲洗，将菲薄的黏膜层从黏膜下组织小心地翻揭分离下来（略呈黄色的一面是上皮层）→黏膜剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化（37℃孵育30min）→消化后在上述有黏膜块的酶溶液内直接加入等量的0.25%胰蛋白酶，轻轻吹打5min →移除黏膜块，细胞悬液进行离心（黏膜块可用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗后再予去除，冲洗液也同样进行离心）→沉淀中加入适量含血清培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。
方法二：组织块培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织块进行冲洗、浸泡、并剪碎（1mm×1mm大小）→黏膜块剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化（37℃孵育过夜）→离心（1000r/min，4℃5min）→弃去上清，沉淀中加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。
方法三：ABC培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织块进行冲洗、浸泡、并剪碎（1mm×1mm大小）→黏膜块剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶(酶量为组织块体积的5倍)消化（37℃孵育过夜）→第2天取出，轻轻吹打，将细胞悬液移走，组织块留在培养瓶内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中。
采用ABC贴壁法行原代培养。
即取A、B、C3个培养瓶。
将细胞悬液先种于A瓶，在CO2培养箱中孵育10min，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中到瓶角后慢慢吸出全部培养液，接种到B瓶，CO2培养箱中孵育10min，同法将细胞悬液转入C瓶中。
控制培养液液面高度在2-5mm，以去除鼻黏膜上皮细胞中的成纤维细胞和红细胞。
再置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中孵育24h，培养液更换为含生长因子培养液，隔日换液1次。
细胞培养步骤
一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。
原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。
利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。
其操作步骤如下。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。
用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。
4. 注意事项（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。
（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。
可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。
原代细胞培养方法
原代细胞培养方法原代细胞培养方法一、介绍原代细胞培养的概念和重要性：原代细胞是从人或动物体内初次分离出的细胞，具有体内组织原始性和遗传特性的稳定性。
原代细胞培养是一种重要的实验手段，广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域。
通过原代细胞培养，可以研究细胞的生长、分化、凋亡以及与疾病相关的分子机制等。
二、准备原代细胞培养的基本设备和试剂：1. 培养箱和细胞培养用的培养皿：培养箱提供恒温和湿度控制，保持培养环境的稳定；培养皿用于细胞的贴壁培养和传代。
2. 细胞培养无菌耗材：如细胞培养板、培养瓶、离心管等。
3. 细胞培养液：如DMEM、RPMI 1640等。
需根据实验需求选择适当的培养液，并添加适当浓度的血清、生长因子等。
4. 酶消化液：如胰蛋白酶、胶原酶等，用于细胞的分离和传代。
5. 生物安全柜和消毒液：用于操作细胞时的无菌保护和实验室的消毒。
三、原代细胞培养的步骤：1. 组织样本的收集：选择合适的组织样本，如肺、肝脏、肾脏等，进行无菌采集。
2. 组织的消化：将组织样本切成小块，加入适量的酶消化液，在恒温摇床上消化一段时间，使细胞分散。
3. 细胞的离心和洗涤：将消化后的细胞离心，去除酶消化液，并用适量的培养液洗涤细胞，去除残留的异物和垃圾。
4. 细胞的贴壁培养：将洗涤好的细胞转移到培养皿中，加入适量的培养液，将培养皿放入培养箱中，培养维持适当的温度和湿度。
5. 细胞的传代：当细胞达到一定密度时，用酶消化液进行细胞的分离和传代，将细胞转移到新的培养皿中，以保证细胞的生长和扩增。
四、原代细胞培养的注意事项：1. 保持无菌操作：在生物安全柜中进行细胞培养，并使用无菌试剂和耗材，避免细菌和真菌的污染。
2. 控制培养条件：根据不同细胞类型的要求，调整培养液中的成分和浓度，以及培养箱中的温度和湿度。
3. 注意细胞的健康状态：细胞的形态、增殖情况和凋亡等指标应定期观察和记录，及时发现和解决细胞培养中的问题。
4. 合理的细胞传代次数：每个细胞类型的传代次数有一定限制，过多的传代会导致细胞功能和稳定性的下降。
2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准
2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准胃肠道恶性肿瘤是威胁我国人民生命健康的公共卫生问题之一。
良好的实验模型是解析肿瘤发病机制和研发临床治疗新方法的有力工具。
高质量的生物医药研究需要实验模型尽可能再现来源组织的生理、病理状态。
类器官（Organoid）便是新近发展起来的一种新型实验模型。
类器官是指将部分活组织在体外3D培养基中扩增、传代形成的小器官样细胞团。
类器官在组织细胞构成、生物学功能及基因组变异谱上均与其来源组织有极高的相似性。
类器官具有制备周期短、可以长期低温保藏和可重复使用等诸多优势。
近年来，国内外较多机构开展该领域的工作并积累了一定的经验。
为了使胃肠道肿瘤研究中类器官相关技术得到有效利用和健康发展，作者以采用常用实验耗材与试剂为例，就类器官构建中组织样本前处理、类器官构建、类器官冻存与复苏、类器官生长状态评估以及类器官质量控制等关键技术提出可参照标准。
类器官构建的总原则此标准是基于酶消化法将人胃肠道正常黏膜上皮和胃肠道腺癌组织制备成单个细胞悬液,再将细胞与3D培养支架（此处指基质胶）混合形成3D胶滴,再加入市售的胃肠道上皮专用完全培养基进行培养（类器官专用特定培养基是指含有所培养组织细胞需要的生长因子、细胞因子以及小分子化合物）。
其目的是模拟胃黏膜上皮的生长微环境，促使胃肠道干细胞分化成为各种类型的胃肠道黏膜上皮细胞，同时还可维持胃肠道干细胞或多能干细胞的干性，实现体外长期培养、传代目的，便可培养出与胃肠道黏膜组织结构功能类似的活组织类器官。
类器官培养中涉及到的供体生物样本来源均以自愿同意参与科学研究为原则，并以签署知情同意书QnfOrmedConSent)为具体体现。
主要试验耗材与试剂主要耗材包括24孑麻、1.5mLEP管、15mL离心管、培养皿、50mL离心管、移液管、无菌吸头、冻存管、巴氏吸管、移液器、无菌棉球、银子、组织剪、70~100μm细胞过滤器(Coming)、细胞程序性冻存盒等。
原代细胞培养概念原理方法举例
3.过滤与洗涤：将 消化的组织块吹打 均匀，用80到200目 不锈钢筛网过滤， 离心洗涤过滤的细 胞与细胞团
4,根据细胞计数用 培养基制备适当浓 度（一般为0.5到2 乘以10的6次方每毫 升） 5.分装培养瓶，37 度或者加5%二氧化 碳，进行培养。
6.长成单层后可换 乘维持液应用，或 者最好进行传代后 再应用
基本的程序：
织洗涤，剪碎成12mm大小的组织碎 片
以鸡成纤维细胞培养为 实验目的 例，初步了解原代细胞 培养的操作程序和要点。
9-11日龄鸡胚1只，营养 实验材料 液，Hank液，碘酒，酒 精，蛋架，手术器械， 平皿，吸管，培养瓶等
5.用吸管将小组织快吸
入装有10ml的1.125%胰
酶消化液体的三角瓶中， 4.无菌小剪刀将鸡胚剪 2.用消毒弯剪刀剪去气 成1-2mm的小块，用 Hanks液体洗涤2-3次， 充分洗去红血球，吸弃 扎进瓶口，置于37度水 浴静止消化10到15 分钟， 期间可摇动1-2次，观察 消织快周边出现 微绒毛状，此时稍加摇 动即有大量细胞游离， 液体变混，取出三角瓶， 用吸管吹打数次，以助 细胞分散。悬液经四层 纱布过滤后，滤液用 500到1000转每分钟离 心5分钟，吸去上清， 加营养液吹打，分散细 胞，制成均匀悬液。
原代细胞的培养
原代细胞的培养：供体获取组织后进行的首次培养。
最大的优点:细胞刚离开机体，生物学性状与原体内细胞比较接近，适用于做药物检测等实验，同时初代 细胞培养也是建立各种细胞株（系）必须经过的阶段，因此它是组织培养工作者应该熟知和掌握的技术。
2.用分散剂消化分 1.处理组织，将组 散组织块，如加入 组织量大30到50倍 的胰酶消化液，消 化30到60分钟（冷 消化过夜）
7.取细胞悬液计数后，
一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710212294.8(22)申请日 2017.04.01(71)申请人 兰州大学地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水南路222号(72)发明人 韩俭 王礼 彭琦 孙旭冬 任弟娟 张富花 徐媛媛 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理有限公司 11249代理人 姜司晨(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)C12N 1/20(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法(57)摘要本发明公开了一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，包括以下步骤：1）配制幽门螺杆菌培养基；2）将培养基加入无菌细胞培养瓶制成斜面；3）将胃黏膜上皮细胞在已形成斜面的培养瓶中培养贴壁；4）取幽门螺杆菌48h菌液离心后用细胞培养液重悬；5）将重悬菌液加入至已有贴壁细胞和斜面培养基的培养瓶中培养，每天计数活菌量并观察细胞形态学变化。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种全新幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养方法。
在新体系中，幽门螺杆菌正常生长，持续刺激贴壁细胞产生病变，起到很好模拟感染人胃黏膜时的状况。
解决了传统法中直接加入幽门螺杆菌，因培养液不适宜于其生长而造成衰退或死亡，难以有效刺激细胞的问题。
权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 106947732 A 2017.07.14C N 106947732A1.一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）配制用于培养幽门螺杆菌的哥伦比亚琼脂固体培养基并以高温高压湿热灭菌，待固体培养基冷却至50℃-60℃时，加入葡萄糖溶液和新生小牛血清，充分混匀，得到幽门螺杆菌培养基；2）取步骤1）得到的幽门螺杆菌培养基10ml，加入到50ml无菌细胞培养瓶中，并使细胞培养瓶的下底面与水平面成30度角，待培养基冷却凝固在瓶底形成斜面后，水平或竖直放置培养瓶备用；3）取含胃黏膜上皮细胞5×104个/ml的细胞悬液3ml加入至步骤2）得到的细胞培养瓶，将细胞培养瓶水平放置入细胞培养箱中，10%CO 2、37℃培养24h，使胃黏膜上皮细胞贴壁；4）取已经培养了48h处于稳定期的幽门螺杆菌菌液1ml进行离心，离心转速为800rpm，离心时间为5min，弃去上清后加入细胞培养液1ml重悬，得到重悬菌液；5）将步骤4）得到的1ml重悬菌液加入至步骤3）得到的胃黏膜上皮细胞已经贴壁的细胞培养瓶中，再将细胞培养瓶放入专门用于幽门螺杆菌培养的培养箱中继续培养，培养条件：37℃、湿度90%、微需氧气体环境，即气体环境含按照体积百分比计的5%O 2、10%CO 2和85%N 2，之后每天计数培养瓶液体中幽门螺杆菌的活菌量并观察细胞的形态学变化，收集作用后的细胞和细菌。
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色均 呈 紫 红 色 ， 见细 胞 核 旁 黏 原 颗 粒 ； 种 密 度 低 时 ， 成 团细 胞 Ｐ Ｓ染 色 呈 阳性 ； 养 第 ３ｄ 绝 大 部 分 细 胞 Ｃ ． 可 接 仅 Ａ 培 ， Ｋ
１ ８阳性 。接 种 第 ２ ｄ 胃黏 膜 上 皮 细 胞 成 团簇 状 生 长 ． ． 增殖 迅 速 ． ４ｄ后 逐 渐 停 止 生 长 ． ５ ｄ开 始 出 现漂 浮死 亡 细 第 第
背 景 ： 代 培 养 的人 正 常 胃黏 膜 上 皮 细 胞 与 体 内姊 妹 细 胞 相 似 ， 进 行 胃生 理 和病 理 研 究 的理 想 工 具 ， 我 国 原 是 但 尚未 见 简 便 、 靠 的人 正 常 胃黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 养 方 法 的报 道 。 目的 ： 讨 简 便 的人 正 常 胃 黏 膜 上 皮 细 胞 原 代 培 可 探
养 方 法 。 法 ： 胶 原 酶 Ⅱ和分 散 酶 磁 性 搅 拌 分 离 人 正 常 胃黏 膜 上 皮 细胞 。 甲基 噻 唑 基 四唑 （ ｆ ） 方 以 以 Ｍ１ｒ 比色 法 检 测 细 胞
活 力 ． 观察 细 胞 大 体 生 长 过 程 ： 以 以溴 脱 氧 尿 苷 （ ｒ Ｕ） 记 法 检 测 Ｓ期 细 胞 数 量 ， 观察 细 胞 微 观 增 殖 能 力 。以 Ｐ Ｓ Ｂｄ 标 以 Ａ 染 色 鉴 定 胃黏 膜上 皮细 胞 黏 原 颗 粒 ； 以细 胞 角蛋 白 （ Ｋ）１ Ｃ 一 ８免 疫荧 光染 色鉴 定 上 皮 细 胞 。 以光 学 显 微 镜 和 透 射 电 子
显 微 镜 观 察 细 胞 形 态结 构 。 步 观 察 传 代 细 胞 的 贴 壁 生 长情 况 。 果 ： 养 第 ２ ３ｄ 胃黏 膜 上 皮 细 胞 活 力增 幅 最 大 ， 初 结 培 ～ ，
第 ４ｄ达最 高点 ， 之后 逐 渐 下 降 ： ｒＵ 孵 育 １ Ｂｄ ８ｈ后 ，３３ ３． ％的 细 胞 处 于 和 曾经 处 于 Ｓ期 。接 种 密 度 高 时 ， 胞 Ｐ Ｓ染 细 Ａ
Ｆ Ｎ ｉ ｃ ｕ， Ｇ Ｏ Ｌｐｎ ， ＷＡ ｉｉ ， Ｌ Ｏ Ｙ ａ ｈ ｉ Ｚ Ｕ Ｊ ｎｈｎ ． Ｄ ｐ ｒ ｅｔ ｆＧ ｓ ｏｎｅｏ ｇ， Ａ ＧＤａ ｈｎ ｎ Ｕ ｉｉ ｇ ＮＧＺｑ￣ｇ Ｕ ｕｎ ｕ ， ＨＯ ｉ ｃａ ｇ ａ ｅａｔ ｎ ａｔ ｅｔｒｌ ｙ ｍ ｏ ｒ ｏ
胞 ， 终 完全 被 成 纤 维细 胞 取 代 ； 射 电 子显 微 镜 可 见 微绒 毛 、 泌颗 粒 、 接 复 合 体 等上 皮 细 胞 特 征 。传 代 胃黏 膜上 最 透 分 连 皮细 胞 增 殖 、 铺展 能 力较 原 代 细胞 降 低 。结 论 ： 性 搅拌 酶 分 离培 养 可 得 到数 量 多 、 磁 纯度 高 的 人 正常 胃黏膜 上 皮 细胞 。
维普资讯
胃肠 病 学 ２ ０ ０ ７年 第 ｌ ２卷 第 １期
பைடு நூலகம்
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种简便 的人正常 胃黏膜 上皮细胞原代培 养方法木
程永 波 房殿 春 郭立 萍 王 自强 。 罗元 辉 周 建嫦
第 三 军 医 大 学 西 南 医 院 消 化 内 科 ’ ０ ０ ８ 普 外 科 （ ０３ ） ４
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关键词 上 皮 细胞 ； 胃黏 膜 ； 细 胞 培 养 技 术
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