8吸光光度法
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吸光光度法显色反应及显色条件的选择
吸光光度法 / 显色反应及显色条件的选择
• 干扰的消除 • 共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物， 都将干扰测定。 • 消除共存离子的干扰的方法： • 加人配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色 配合物或无色离子。
吸光光度法 / 显色反应及显色条件的选择
• 选择适当的显色条件以避免干扰 • 利用酸效应，控制显色剂离解平衡，降低[ R ] ，使干扰 离子不与显色剂作用
• 此类化合物在一定的条件下就能与某些金属离子作用，改 变生色团的电子云结构，使颜色发生明显的变化。
吸光光度法 / 显色剂
• • • • • • 偶氮类显色剂特点 性质稳定 显色反应灵敏度高 选择性好 对比度大 是目前应用最广泛的一类显色剂。其中以偶氮胂III 等最为 突出。偶氮胂III的结构式为
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
• 吸收光谱重叠 • 找出两个波长，在该波长下，二组分的吸光度差值 △ A 较大
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
• 在波长为λ1和λ2时测定吸光度 A1和 A 2 ，由吸光度值的 加和性得联立方程：
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
吸光光度法 / 吸光光度法的应用
吸光光度法 / /显色反应及显色条件的选择 •进行光度分析时，首先要把待测组分转变成有色化合物， 然后测定吸光度或吸收曲线 •将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应 •与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂
吸光光度法 / 显色反应及显色条件的选择 显色反应的分类 •配位反应----最主要的显色反应 •氧化还原反应 显色反应的选择 •灵敏度高 摩尔吸收系数 K 的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志 应当选择生成的有色物质的‘较大的显色反应
吸光光度法 / 显色剂
吸光光度法
第20 章吸光光度法吸光光度法(light absorption method)是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
包括比色法（colorimetric method）和分光光度法（spectrophotometry）。
前者是通过比较有色溶液颜色深浅来确定有色物质的含量；后者是根据物质对一定波长光的吸收程度来确定物质的含量的。
分光光度法包括紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）、可见光分光光度法（visible spectrophotometry）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）。
本章主要讨论可见光分光光度法。
20.1 概述20.1.1 物质对光的选择性吸收1. 光的性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。
光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是其波动性的反映，波长λ与频率ν之间的关系式：λν=c （c为光速）亦反映光的波动性。
光又是由大量具有能量的粒子流所组成，这些粒子称为光子。
光子的能量则反映微粒性，光子的能量E 与波长λ的关系：E = hν = hc/λ（h为普朗克常量）亦可用来表示光的微粒性。
由上述关系可知，光子的能量与光的波长（或频率）有关，波长越短，光能越大，反之亦然。
光的能量范围很广，在波长或频率上相差大约20个数量级。
不同光的波长范围及其在分析化学中的应用情况见表20-1。
表20-1 各种光的波长范围及其在分析化学中的应用情况光的名称波长范围跃迁类型分析方法X-射线远紫外光近紫外光可见光近红外光中红外光远红外光微波无线电波10-1~ 10nm10 ~ 200nm200 ~ 400nm400 ~ 750nm0.75 ~ 2.5μm2.5 ~ 50μm50 ~ 1000μm0.1 ~ 100cm1 ~ 1000mK和L层电子中层电子价电子价电子分子振动分子振动分子振动和低位振动分子转动X射线光谱法真空紫外光度法紫外光度法比色及可见光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核自旋共振光谱2. 物质的颜色与其对光的选择性吸收光可分为单色光与复合光，单色光（chromatic light）是仅具有单一波长的光，而复合光（polychromatic light）是由不同波长的光（不同能量的光子）所组成。
吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类
Ak1b
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
第8章吸光光度法
MR + H+
显然，增大酸度对显色 反应不利。 ⑴影响显色剂浓度和颜色； ⑵影响Mn+的存在状态;
⑶影响配合物的组成。
实际工作中，作 A ～ pH 曲线，寻找适宜 pH 范围。
A
pH
3、显色温度的选择： 一般在室温，有时需加热，通过实验确定
4、显色反应时间：制作吸光度-时间曲线
(c(M)、 c(R) 、 pH一定)
一、显色反应的选择：
1、显色反应的类型：配位反应和氧化还原反应。 2、对显色反应的要求： ⑴灵敏度足够高:κ＞105 超高灵敏，κ=(6~10)104 高灵敏,κ=(2~6)104中等，κ＜2×104不灵敏 ⑵显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空白小。 对比度：两有色物质最大吸收波长之差 Δλ=|λMAXMR-λMAXR|≥60nm
2、吸收曲线：测量某 种物质对不同波长单色 光的吸收程度，以波长 为横坐标，吸光度为纵 坐标，得到的一条吸收 光谱曲线。
（1）用途： ①进行定性分析； ②进行定量分析； ③选择吸收波长； ④判断干扰情况。
9
定性分析与定量分析的基础
不同物质吸收光谱的形状以及max 不同
B 定性分析基础 物质对光的选择 吸收
练习题
1、人眼能感觉到的光称为可见光，其波长范围 是 A。400~780nm B。200~320nm C。200~780nm D。200~1000nm 答案： A 2 、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大 时，最大吸收波长和吸光度分别是 A。不变，增加 B。不变，减少 C。增加，不变 D。减少，不变 答案： A
Ia
透光率 （透射比）Transmittance
吸光光度法的灵敏度与准确度知识讲解
A
50℃
25℃
t /min
另外，还有介 质条件、有机 溶剂、表面活 性剂等.
16
8.4.3 测定中的干扰以及消除方法
1.化学法
测Co2＋ :(掩蔽法)
Co2+, Fe3+
⑴NaF
Co2+ FeF63-
SCN－ Co(SCN)2 (蓝)
(2)Sn2+
Co2+ Fe2+,Sn4+
SCN－ Co(SCN)2
HL
H＋＋L
HL、L 颜色不同
Ka＝[H+][L]/[HL]
配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A.
A = H L [ H L ] + L [ L ]= H L K [ a H + + ] [ H c ( + ] H L ) + L K K a a + [ c H ( + H ] L )
高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHL＝εHL·c(HL)；
c(R)≈[R´]=10-4mol·L-1
3
[FeR3] [Fe][R]3
3 3
Fe(A)
R(H)
lg[F [F e R e ] 3] lg3 lgF e (A ) 3 lgR (H ) 3 lg [R ]
14
lg [F eR 3 ] [F e]
pH3～8为适宜 的酸度范围
15
3. 显色温度及显色时间 (c(M)、 c(R) 、 pH一定)
8.4.1 显色剂与显色反应
生色团：－N＝N－，－N＝O，
O
C=S,－N
（共轭双键）πe
O
： ：： ：
助色团－NH，－OH，－X （孤对电子）ne
第8章 光度法答案(1)
第8章吸光光度法一、选择题1.符合朗伯-比尔定律的一有色溶液，当有色溶液的浓度增加时，最大吸收波长和吸光度分别是（ A ）A.不变、增加B.不变、减少C.增加、不变D.减少、不变2.相同质量的铁和镉（M Fe=55.85g·mol-1，M Cd=112.4 g·mol-1）各用一种显色剂在同样体积溶液中显色，用分光光度法测定，前者用2cm比色皿，后者用1cm比色皿，测得的吸光度相同，则两有色络合物的摩尔吸光系数为（ D ）A.基本相同B.铁为镉的两倍C.镉为铁的两倍D.镉为铁的四倍3.在符合朗伯-比尔定律的范围内，有色物的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系（ B ）A.增加，增加，增加B.减小，不变，减小C.减小，增加，增加D.增加，不变，减小4.以下说法错误的是（ A ）A.摩尔吸光系数ε随浓度增大而增大B.吸光度A随浓度增大而增大C.透光率T随浓度增大而减小D.透光率T随比色皿加厚而减小5.符合朗伯比耳定律的一有色溶液，通过1cm比色皿，测得透光率为80%，若通过5cm的比色皿，其透光率为（C ）有色配合物的摩尔吸光系数ε与下述各因素有关的是（ C ）A.比色皿的厚度B.有色配合物的浓度C.入射光的波长D.配合物的稳定性7.下列表述中错误的是（ A ）A.比色分析所用的参比溶液又称空白溶液B.滤光片应选用使溶液吸光度最大者较适宜C.当摩尔吸收系数ε在105～106L/（mol·cm）范围内，可认为该反应的灵敏度是高的。
D.吸光度具有加和性8.符合比尔定律的有色溶液，浓度为c时，透光率为T0，浓度增大一倍时，透光率的对数为（D）2 2lg T09.一有色溶液对某波长光的吸收遵守吸收定律。
当选用2.0cm的比色皿时，测得透光率为T，若改用1.0cm的吸收池，则透光率应为（ D ）T2 D.10.吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是（ B ）A.0.1～某金属离子M与试剂R形成一有色配合物MR，若溶液中M的浓度为×10-4mol·L-1，用1cm比色皿于波长525nm处测得吸光度A为，此配合物在525nm处的摩尔吸光系数为（ B ）A.4.0×10-3B.×103C.×10-4 二、填空题1.某显色剂R与金属离子M和N分别形成有色配合物MR和NR，在某一波长下测得MR和NR的总吸光度A为。
8吸光光度法
四、显色反应和显色条件的选择
(2) 显色溶液的pH值
例： pH=1.8~2.5
Fe(ssal)+ 紫红色
pH=4~8
Fe(ssal)-2 橙红色
pH=8~11.5
Fe(ssal) 3 3- 黄色
常用的光源 :
可见光区: 钨灯 (辐射波长为320nm~2500nm) 紫外区: 氢灯、氘灯(辐射波长为185nm~400nm)
31
三. 仪器和方法
＊ 单色器（滤光片、棱镜或光栅）
作用 :
将光源发射的复合光分解成单色光的光学系统
1. 滤光片----光电比色计的单色器
组成：由有色玻璃制成
作用：只允许和它颜色相同的光通过，得 到的是近似的单色光
选择的原则：滤光片最易通过的光是有色溶液
最易吸收的光
互补色
32
三. 仪器和方法 2. 棱镜或光栅
----分光光度计的单色器
由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成
组成 :
入射狭缝：光源的光由此进入单色器
准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束
色散元件：将复合光分解成单色光
聚焦装置：将分光后的单色光聚焦至出射狭缝
（透镜或凹面镜）
33
三. 仪器和方法 ＊ 样品室（石英池和玻璃池） 用于放置各种类型的吸收池(比色皿)和相 应的池架附件
石英或玻璃池，紫外区一定要用石英池
厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, …cm
36
三. 仪器和方法
＊检测系统 光电管或光电倍增管
将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。 要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，
17
二 . 吸光光度法的基本原理
吸光光度法
单位: L·mol-1 ·cm-1
（1）吸收系数
第一、吸收系数a
当c的单位为g/L，b的单位为cm时，K用a表示 ，称为吸收系数，其单位为L/g·cm，这时朗伯-比 耳定律变为： A＝abc
第二、摩尔吸收系数κ
当式中浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位 为cm时，则用另一符号κ表示，称为摩尔吸收系数 ，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时 ，溶液的吸光度。其单位为L/mol·cm。这时朗伯比耳定律就变为: A＝κbc
4、检测系统(又叫光电转化器)
在光度计中，常用的是硒光电池。硒光电池和眼睛相 似，对于各种不同波长的光线，灵敏度是不同的。对于波 长为500-600nm的光线最灵敏。而对紫外线，红外线则 不能应用。
光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中。具 有灵敏度高、光敏范围广及不易疲劳等特点。
1、选择性要好
一种显色剂最好只与一种被测组分起 显色反应，这样干扰就少。或者干扰离 子容易被消除、或者显色剂与被测组分 和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰 相隔较远。
3、对比度要大
如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的 最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上 。
5、显色反应的条件要易于控制
但有时会发生偏离, 特别在浓度较大时, 偏离更大.
原因:1)非单色光、非0平行光 c 2)化学因素:离解、缔合、异构化等
1、物理因素
（1）单色光不纯所引起的偏离
严格地讲，朗伯-比耳定律只对一定波长的单色 光才成立。但在实际工作中，目前用各种方法得到 的入射光并非纯的单色光，而是具有一定波长范围 的单色光。那么，在这种情况下，吸光度与浓度并 不完全成直线关系，因而导致了对朗伯—比耳定律的 偏离。
（1）吸收系数
第一、吸收系数a
当c的单位为g/L，b的单位为cm时，K用a表示 ，称为吸收系数，其单位为L/g·cm，这时朗伯-比 耳定律变为： A＝abc
第二、摩尔吸收系数κ
当式中浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位 为cm时，则用另一符号κ表示，称为摩尔吸收系数 ，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时 ，溶液的吸光度。其单位为L/mol·cm。这时朗伯比耳定律就变为: A＝κbc
4、检测系统(又叫光电转化器)
在光度计中，常用的是硒光电池。硒光电池和眼睛相 似，对于各种不同波长的光线，灵敏度是不同的。对于波 长为500-600nm的光线最灵敏。而对紫外线，红外线则 不能应用。
光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计中。具 有灵敏度高、光敏范围广及不易疲劳等特点。
1、选择性要好
一种显色剂最好只与一种被测组分起 显色反应，这样干扰就少。或者干扰离 子容易被消除、或者显色剂与被测组分 和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰 相隔较远。
3、对比度要大
如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的 最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上 。
5、显色反应的条件要易于控制
但有时会发生偏离, 特别在浓度较大时, 偏离更大.
原因:1)非单色光、非0平行光 c 2)化学因素:离解、缔合、异构化等
1、物理因素
（1）单色光不纯所引起的偏离
严格地讲，朗伯-比耳定律只对一定波长的单色 光才成立。但在实际工作中，目前用各种方法得到 的入射光并非纯的单色光，而是具有一定波长范围 的单色光。那么，在这种情况下，吸光度与浓度并 不完全成直线关系，因而导致了对朗伯—比耳定律的 偏离。
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配制一组标准浓度系列
目视比色法
[Fe(SCN)n]3-n
Cx c1 c2 c3 c4 c5
三. 仪器和方法 分光光度法 : 仪器—分光光度计
基本组成：
光源 单色器 样品室 检测器
显示器
三. 仪器和方法
＊ 光源 (钨灯、氢灯、氘灯）
基本要求 :
能发射紫外光区或可见光谱区的连续光谱； 足够的辐射强度、稳定性较好、使用寿命较长
一. 概述 吸光光度法:
基于物质对光的选择性吸收而建立的 分析方法。
分类：根据物质所吸收光的波长范围不同， 分为紫外、可见及红外分光光度法。 基本方法： 有色物质浓度 ~ 颜色深浅 ~ 吸收光程度 通过比较颜色深浅（吸收光程度），测 定物质的浓度。
一. 概述
方法分类和比较
比色分析法
测定下限
10-5 ~ 10-6 mol·L-1 5% ~ 10%
(1)光电管
(2)光电二极管阵列
三. 仪器和方法
(1)光电管
涂光敏材料
光照 光敏材料 光强度大
产生电子
电压
产生电流 电流大
三. 仪器和方法
(2)光电二极管阵列
光照射
电容器 充电 电容器 放电
再次充电 测量周期
电容器充电的电量每个二极管检测到的光子 数目成正比光子数与光强度成正比。通过测量整 个波长范围内光强的变化就可得到吸收光谱。
三. 仪器和方法
＊显示器
由检流计、数字显示、微机组 成的自动控制和结果处理系统
四、显色反应和显色条件的选择
1.显色剂作用 2. 显色反应的选择 3. 影响显色反应的因素
4. 显色剂的分类
四、显色反应和显色条件的选择
1.作用
无色或浅色 +显色剂 有色物 试样 配合反应 比色
显色反应
氧化还原反应 缩合反应 重氮化—偶氮化反应
= abc
A ∝ cb 当一束平行单色光通过溶液时，溶液的 吸光度A与溶液的c和b成正比。 当 b 一定时， A ∝ c， 可以定量
二 . 吸光光度法的基本原理
注意 :
A = lg
I0 I
= abc
（1） 物质不吸光， I=Io ， A=0 物质吸收部分光， I＜Io， A＞0 吸收光 ， A ， 物质浓度 。
吸光光度法
王 燕
光分析方法
可见分光光度法 紫外可见分光光度法 原子吸收法
分子光谱
原子光谱
红外光谱法
光谱分析法
原子发射法 荧光光谱法 核磁共振法
概述
吸 光 光 度 法
原理
物质对光的选择性吸收
光的吸收定律
仪器和方法 显色反应和显色条件的选择
入射光 测定条件的选择 参比液 读数范围 单组分测定 具体应用 多组分测定 示差法测定
四、显色反应和显色条件的选择
2.显色反应的选择
(1)灵敏度高 (2) 选择性好 (3) 有色物组成恒定，化学性质稳定 (4) 显色剂在测定波长处无明显吸收 κ=104－105
对比度=λmax有色物 -λmax显色剂＞60nm
四、显色反应和显色条件的选择
3.影响显色反应的因素
M + R MR (1) 显色剂用量 根据吸光度A与显色剂浓度cR的关系来确定
分光光度法
10-5 ~ 10-8 mol·L-1
相对误差
2% ~ 5%
适用于分析半微量和微量的物质
一. 概述
方法的评价 快速、简便 显色 比色
灵敏度高：浓度下限达10-5~10-6 mol· -1 L
准确度高：相对误差通常为2~5％，
分析有色、无色、浅色物
适用面广
溶液状态、均质固态样品
用于化学平衡等的研究
cR选择——引起A变化最小处的cR（即曲线平坦处）
四、显色反应和显色条件的选择
例：
(2) 显色溶液的pH值
pH=1.8~2.5 pH=4~8 pH=8~11.5 Fe(ssal)+ 紫红色 Fe(ssal)-2 橙红色 Fe(ssal) 3 3- 黄色
测定不同pH值下，显色溶液的吸光度A， 以A为纵坐标，pH为横坐标，制图。 选择曲线平坦处pH 显色时间和温度 由实验得出 溶剂 一般选择水作溶剂
二 . 吸光光度法的基本原理 1.可见光与颜色
阳光 复合光
连续光谱
棱镜 由两种或两种以上波长的光所组成
物质
不连续光谱
可见光区的划分 : λ/nm
400 450 500 550 600 650 760
二 . 吸光光度法的基本原理
互补光的对应关系
光的互补：蓝黄
二 . 吸光光度法的基本原理
2. 物质对光的选择性吸收
二 . 吸光光度法的基本原理
（3）是物质的吸光能力的度量。同一吸收物 质在不同波长下的值不同。在λmax处的 max表 明了吸收物质最大限度的吸光能力，反映了测 定可能达到的最大灵敏度。 （4） max越大表明该物质的吸光能力越强， 用光度法测定该物质的灵敏度越高。 >105：超高灵敏； = (6~10）×104 ：高灵敏； = 104~103 ：中等灵敏； < 103 ：不灵敏。
-6
-6
= 8 . 9 × 10
-6
mol • L
-1
A = κbc
∴κ = A cb = = 1 . 1 × 10 L • mol ×2
4 -1
• cm
-1
二 . 吸光光度法的基本原理 4. 吸光度测定方法
(1) 配制一组浓度系 列的标准溶液（ci）
步骤
仪器测量
一组相应的吸 光度值（Ai） 工作曲线
例1=2 A2 A1 1 2 但 A1 》 A2 0
在max
处
单色光不纯
但 κ2=0
测量误差较小
二 . 吸光光度法的基本原理
2）溶液本身引起的偏差
（1）若溶液浓度＞0.01mol· -1时，粒子 L 间的相互作用 （2）溶液以胶体、乳浊、悬浮状态存在 时，有反射、散射作用
二 . 吸光光度法的基本原理
若入射光包含λ1和λ2二种波长光, 当照射试样后
Io
Io1 试 样 Io2 I2 I1 I
按光吸收定律:
A 1 = κ λ1 cb = lg I o1 I1
A总 A 1 A 2
A 2 = κ λ2 cb = lg I o2 I2
-κ λ2 cb
I 1 = I o1 × 10
二 . 吸光光度法的基本原理 A、T% 和c 的关系
A = abc
- lg T % = A = abc
A、T% 、c 。
二 . 吸光光度法的基本原理
（6） 吸光系数的二种表示形式
A=abc A= bc
吸光系数a
摩尔吸光系数
浓度为1g/L的溶液，在某 浓度为1mol/L的溶液， 波长时，用1cm的比色皿， 在某波长时，用1cm的比 意义 所测得的吸光度 色皿，所测得的吸光度 L/g· cm L/ mol · cm
仪器测量
A
制图（ci 为横坐标， Ai 为纵坐标） · · (2) 配制样品
Ax ·
Ax
相同条件
· ·
查图得出cx
cx
c
二 . 吸光光度法的基本原理
5. 偏离Beer-Lanbert定律的原因
出现的现象： A与c偏离线性 在高浓度端， 工作曲线呈弯曲状。 产生原因：
c A
1） 单色光不纯
现有仪器无法获得纯单色光，只能获得小 范围的复合光。
（透镜或凹面镜）
三. 仪器和方法 光栅分光原理
利用不同波长入射光产生干涉条纹的衍射 角不同而将复合光分成单色光。
三. 仪器和方法
＊ 样品室
用于放置各种类型的吸收池(比色皿)和相 应的池架附件
比色皿: 石英池和玻璃池 比色皿厚度: 0.5, 1, 2, 3, …cm
三. 仪器和方法
＊ 检测器（光电管或光电倍增管） 作用:通过光电效应，使透过吸收池的光 信号变成可测的电信号的装置。 要求：对测定波长范围内的光有快速、 灵敏的响应，产生的光电流应与照射于 检测器上的光强度成正比。
二 . 吸光光度法的基本原理 （3）溶液内部的化学变化
包括离解、缔合、生成新物质、形成异构体
使原物质浓度改变
吸光度值变化 产生偏离
2 CrO
24
例:
Cr 2 O 7 + H 2 O
2-
+ 2H
+
(橙色)
κ Cr
2O 7 2-
(黄色)
>> κ CrO
24
λmax=450nm
pH
， 平衡
移,
A总
三. 仪器和方法
- κ λ1 cb
+ I o2 × 10
- κ λ2 cb
讨论 :
当为纯单色光时， λ1=λ2
κλ1= κλ2
A总= κλ1bc
当单色光不纯时， λ =λ 1 2 A总∝ c
κλ1= κλ2
线性破坏
结论： 单色光纯度越差，线性越差
二 . 吸光光度法的基本原理
减少单色光不纯引起偏差方法 ——— 在max处测量
I dI I
k 1 db k 1 db
0 b
吸光度 I
k 2c
A g
I0 I
k 1b
二 . 吸光光度法的基本原理
Beer - Lanbert定律——光吸收定律
I0
A = lg
A——吸光度 a——吸光系数 b——光程距离
I Io ——入射光强度 I——透射光强度 c——浓度
单位
二 . 吸光光度法的基本原理
摩尔吸收系数κ的讨论
（1）在数值上等于c=1 mol · -1、b=1cm时该溶 L 液在某一波长下的吸光度。是吸收物质在一定波 长和溶剂下的特征常数。 （2）不随c和b的改变而改变。在温度和波长等 条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，
目视比色法
[Fe(SCN)n]3-n
Cx c1 c2 c3 c4 c5
三. 仪器和方法 分光光度法 : 仪器—分光光度计
基本组成：
光源 单色器 样品室 检测器
显示器
三. 仪器和方法
＊ 光源 (钨灯、氢灯、氘灯）
基本要求 :
能发射紫外光区或可见光谱区的连续光谱； 足够的辐射强度、稳定性较好、使用寿命较长
一. 概述 吸光光度法:
基于物质对光的选择性吸收而建立的 分析方法。
分类：根据物质所吸收光的波长范围不同， 分为紫外、可见及红外分光光度法。 基本方法： 有色物质浓度 ~ 颜色深浅 ~ 吸收光程度 通过比较颜色深浅（吸收光程度），测 定物质的浓度。
一. 概述
方法分类和比较
比色分析法
测定下限
10-5 ~ 10-6 mol·L-1 5% ~ 10%
(1)光电管
(2)光电二极管阵列
三. 仪器和方法
(1)光电管
涂光敏材料
光照 光敏材料 光强度大
产生电子
电压
产生电流 电流大
三. 仪器和方法
(2)光电二极管阵列
光照射
电容器 充电 电容器 放电
再次充电 测量周期
电容器充电的电量每个二极管检测到的光子 数目成正比光子数与光强度成正比。通过测量整 个波长范围内光强的变化就可得到吸收光谱。
三. 仪器和方法
＊显示器
由检流计、数字显示、微机组 成的自动控制和结果处理系统
四、显色反应和显色条件的选择
1.显色剂作用 2. 显色反应的选择 3. 影响显色反应的因素
4. 显色剂的分类
四、显色反应和显色条件的选择
1.作用
无色或浅色 +显色剂 有色物 试样 配合反应 比色
显色反应
氧化还原反应 缩合反应 重氮化—偶氮化反应
= abc
A ∝ cb 当一束平行单色光通过溶液时，溶液的 吸光度A与溶液的c和b成正比。 当 b 一定时， A ∝ c， 可以定量
二 . 吸光光度法的基本原理
注意 :
A = lg
I0 I
= abc
（1） 物质不吸光， I=Io ， A=0 物质吸收部分光， I＜Io， A＞0 吸收光 ， A ， 物质浓度 。
吸光光度法
王 燕
光分析方法
可见分光光度法 紫外可见分光光度法 原子吸收法
分子光谱
原子光谱
红外光谱法
光谱分析法
原子发射法 荧光光谱法 核磁共振法
概述
吸 光 光 度 法
原理
物质对光的选择性吸收
光的吸收定律
仪器和方法 显色反应和显色条件的选择
入射光 测定条件的选择 参比液 读数范围 单组分测定 具体应用 多组分测定 示差法测定
四、显色反应和显色条件的选择
2.显色反应的选择
(1)灵敏度高 (2) 选择性好 (3) 有色物组成恒定，化学性质稳定 (4) 显色剂在测定波长处无明显吸收 κ=104－105
对比度=λmax有色物 -λmax显色剂＞60nm
四、显色反应和显色条件的选择
3.影响显色反应的因素
M + R MR (1) 显色剂用量 根据吸光度A与显色剂浓度cR的关系来确定
分光光度法
10-5 ~ 10-8 mol·L-1
相对误差
2% ~ 5%
适用于分析半微量和微量的物质
一. 概述
方法的评价 快速、简便 显色 比色
灵敏度高：浓度下限达10-5~10-6 mol· -1 L
准确度高：相对误差通常为2~5％，
分析有色、无色、浅色物
适用面广
溶液状态、均质固态样品
用于化学平衡等的研究
cR选择——引起A变化最小处的cR（即曲线平坦处）
四、显色反应和显色条件的选择
例：
(2) 显色溶液的pH值
pH=1.8~2.5 pH=4~8 pH=8~11.5 Fe(ssal)+ 紫红色 Fe(ssal)-2 橙红色 Fe(ssal) 3 3- 黄色
测定不同pH值下，显色溶液的吸光度A， 以A为纵坐标，pH为横坐标，制图。 选择曲线平坦处pH 显色时间和温度 由实验得出 溶剂 一般选择水作溶剂
二 . 吸光光度法的基本原理 1.可见光与颜色
阳光 复合光
连续光谱
棱镜 由两种或两种以上波长的光所组成
物质
不连续光谱
可见光区的划分 : λ/nm
400 450 500 550 600 650 760
二 . 吸光光度法的基本原理
互补光的对应关系
光的互补：蓝黄
二 . 吸光光度法的基本原理
2. 物质对光的选择性吸收
二 . 吸光光度法的基本原理
（3）是物质的吸光能力的度量。同一吸收物 质在不同波长下的值不同。在λmax处的 max表 明了吸收物质最大限度的吸光能力，反映了测 定可能达到的最大灵敏度。 （4） max越大表明该物质的吸光能力越强， 用光度法测定该物质的灵敏度越高。 >105：超高灵敏； = (6~10）×104 ：高灵敏； = 104~103 ：中等灵敏； < 103 ：不灵敏。
-6
-6
= 8 . 9 × 10
-6
mol • L
-1
A = κbc
∴κ = A cb = = 1 . 1 × 10 L • mol ×2
4 -1
• cm
-1
二 . 吸光光度法的基本原理 4. 吸光度测定方法
(1) 配制一组浓度系 列的标准溶液（ci）
步骤
仪器测量
一组相应的吸 光度值（Ai） 工作曲线
例1=2 A2 A1 1 2 但 A1 》 A2 0
在max
处
单色光不纯
但 κ2=0
测量误差较小
二 . 吸光光度法的基本原理
2）溶液本身引起的偏差
（1）若溶液浓度＞0.01mol· -1时，粒子 L 间的相互作用 （2）溶液以胶体、乳浊、悬浮状态存在 时，有反射、散射作用
二 . 吸光光度法的基本原理
若入射光包含λ1和λ2二种波长光, 当照射试样后
Io
Io1 试 样 Io2 I2 I1 I
按光吸收定律:
A 1 = κ λ1 cb = lg I o1 I1
A总 A 1 A 2
A 2 = κ λ2 cb = lg I o2 I2
-κ λ2 cb
I 1 = I o1 × 10
二 . 吸光光度法的基本原理 A、T% 和c 的关系
A = abc
- lg T % = A = abc
A、T% 、c 。
二 . 吸光光度法的基本原理
（6） 吸光系数的二种表示形式
A=abc A= bc
吸光系数a
摩尔吸光系数
浓度为1g/L的溶液，在某 浓度为1mol/L的溶液， 波长时，用1cm的比色皿， 在某波长时，用1cm的比 意义 所测得的吸光度 色皿，所测得的吸光度 L/g· cm L/ mol · cm
仪器测量
A
制图（ci 为横坐标， Ai 为纵坐标） · · (2) 配制样品
Ax ·
Ax
相同条件
· ·
查图得出cx
cx
c
二 . 吸光光度法的基本原理
5. 偏离Beer-Lanbert定律的原因
出现的现象： A与c偏离线性 在高浓度端， 工作曲线呈弯曲状。 产生原因：
c A
1） 单色光不纯
现有仪器无法获得纯单色光，只能获得小 范围的复合光。
（透镜或凹面镜）
三. 仪器和方法 光栅分光原理
利用不同波长入射光产生干涉条纹的衍射 角不同而将复合光分成单色光。
三. 仪器和方法
＊ 样品室
用于放置各种类型的吸收池(比色皿)和相 应的池架附件
比色皿: 石英池和玻璃池 比色皿厚度: 0.5, 1, 2, 3, …cm
三. 仪器和方法
＊ 检测器（光电管或光电倍增管） 作用:通过光电效应，使透过吸收池的光 信号变成可测的电信号的装置。 要求：对测定波长范围内的光有快速、 灵敏的响应，产生的光电流应与照射于 检测器上的光强度成正比。
二 . 吸光光度法的基本原理 （3）溶液内部的化学变化
包括离解、缔合、生成新物质、形成异构体
使原物质浓度改变
吸光度值变化 产生偏离
2 CrO
24
例:
Cr 2 O 7 + H 2 O
2-
+ 2H
+
(橙色)
κ Cr
2O 7 2-
(黄色)
>> κ CrO
24
λmax=450nm
pH
， 平衡
移,
A总
三. 仪器和方法
- κ λ1 cb
+ I o2 × 10
- κ λ2 cb
讨论 :
当为纯单色光时， λ1=λ2
κλ1= κλ2
A总= κλ1bc
当单色光不纯时， λ =λ 1 2 A总∝ c
κλ1= κλ2
线性破坏
结论： 单色光纯度越差，线性越差
二 . 吸光光度法的基本原理
减少单色光不纯引起偏差方法 ——— 在max处测量
I dI I
k 1 db k 1 db
0 b
吸光度 I
k 2c
A g
I0 I
k 1b
二 . 吸光光度法的基本原理
Beer - Lanbert定律——光吸收定律
I0
A = lg
A——吸光度 a——吸光系数 b——光程距离
I Io ——入射光强度 I——透射光强度 c——浓度
单位
二 . 吸光光度法的基本原理
摩尔吸收系数κ的讨论
（1）在数值上等于c=1 mol · -1、b=1cm时该溶 L 液在某一波长下的吸光度。是吸收物质在一定波 长和溶剂下的特征常数。 （2）不随c和b的改变而改变。在温度和波长等 条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，