级本科实验2w凝集反应课件
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凝集反应和沉淀反应课件
第五章 凝集反应和沉淀反应 （P37）
凝集反应 (agglutination reaction)
概念：
细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加 入相应抗体，在电解质存在下，两者 特异性结合，出现肉眼可见的凝集现 象。
Ag 凝集原 agglutinogen Ab 凝集素 agglutinin
颗粒性抗原： 凝集反应
原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体 上，检测未知抗原
反向间接血凝试验结果判定
3.间接凝集抑制反应
方法：
待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab
→ +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性 Ag） → 观察是否有凝集现象
凝集为阴性，说明标本中无相应Ag; 不凝集为阳性，说明标本中有相应Ag
如： 用胶乳凝集抑制试验检测尿液 中绒毛膜促性腺激素（HCG）
体液免疫测定种类及敏感度
反应名称 抗原 结果 敏感度（m g/ml)
直接凝集 颗粒 凝集
0.5~1.0
间接凝集 抗原 现象
0.001~0.003
环沉
20~30
双扩
可溶 沉淀
3~5
单扩
抗原 现象
12~110
放射扩散
3~10
免疫电泳
50~200
思考题：
1.玻片凝集试验和试管凝集试验的区 别
2.反向间接凝集试验、间接凝集抑制 试验的原理及实例
协同凝集试验
协同凝集试验实际是用已知 抗体检测未知抗原，可用于的 细菌、病毒的直接检测
5 明胶凝集试验（gelatin-gglutination ,GAT)
属正向间接凝集反应 方法：
粉红色明胶颗粒吸附病毒抗原（称为致敏 Ag颗粒）+待测血清→观察有无凝集现象。 凝集为阳性，说明血清中含相应的病毒Ab; 不凝集为阴性，说明无相应Ab。 用途：常用于抗HIV-1抗体及抗精子抗体的 检测
凝集反应 (agglutination reaction)
概念：
细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加 入相应抗体，在电解质存在下，两者 特异性结合，出现肉眼可见的凝集现 象。
Ag 凝集原 agglutinogen Ab 凝集素 agglutinin
颗粒性抗原： 凝集反应
原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体 上，检测未知抗原
反向间接血凝试验结果判定
3.间接凝集抑制反应
方法：
待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab
→ +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性 Ag） → 观察是否有凝集现象
凝集为阴性，说明标本中无相应Ag; 不凝集为阳性，说明标本中有相应Ag
如： 用胶乳凝集抑制试验检测尿液 中绒毛膜促性腺激素（HCG）
体液免疫测定种类及敏感度
反应名称 抗原 结果 敏感度（m g/ml)
直接凝集 颗粒 凝集
0.5~1.0
间接凝集 抗原 现象
0.001~0.003
环沉
20~30
双扩
可溶 沉淀
3~5
单扩
抗原 现象
12~110
放射扩散
3~10
免疫电泳
50~200
思考题：
1.玻片凝集试验和试管凝集试验的区 别
2.反向间接凝集试验、间接凝集抑制 试验的原理及实例
协同凝集试验
协同凝集试验实际是用已知 抗体检测未知抗原，可用于的 细菌、病毒的直接检测
5 明胶凝集试验（gelatin-gglutination ,GAT)
属正向间接凝集反应 方法：
粉红色明胶颗粒吸附病毒抗原（称为致敏 Ag颗粒）+待测血清→观察有无凝集现象。 凝集为阳性，说明血清中含相应的病毒Ab; 不凝集为阴性，说明无相应Ab。 用途：常用于抗HIV-1抗体及抗精子抗体的 检测
实验二 凝集 沉淀反应24页PPT
实验二 凝集 沉淀反应
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要Байду номын сангаас托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
实验二抗体制备和凝集反应沉淀反应PPT参考课件
12
Ⅰ 单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
13
Ⅱ 双向琼脂扩散实验:
14
方法：
1. 微波炉中彻底融化1% 琼脂
2. 取5ml 琼脂均匀铺在载玻片上
凝固
3. 在琼脂板上打5个孔
4. 在孔中加入相应样品 5. 37℃, 孵育24h
7
4. 预期结果
上清 清亮 轻度混浊 中等混浊 混浊 与对照相同
沉淀 大的凝集块 大多凝集管底 小、部分凝集块 很小的凝集颗粒 无凝集现象
凝集程度 ++++ +++ ++ + -
8
管底沉淀 凝集程度
最高稀释比例
待测血清的滴度
9
Test 2 沉淀反应
——琼脂扩散实验
10
沉淀反应:
➢ 经典抗原抗体反应的一种。
制备绵羊红细胞溶液20%、 25%、30%、40%
取0.1ml 皮下注射
免疫小鼠
18
素材和资料部分来自 网络，如有帮助请下载!
➢
+
可溶性抗原
➢ 分类:
✓ 琼脂扩散 ✓ 环状沉淀反应 ✓ 絮状沉淀反应 ✓ 免疫电泳
相应抗体
沉淀线或沉淀环
11
➢ 琼脂扩散实验:
✓ 可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例 下形成沉淀线或沉淀环。
✓ 分类:
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量实验
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性实验
Ⅰ 单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
13
Ⅱ 双向琼脂扩散实验:
14
方法：
1. 微波炉中彻底融化1% 琼脂
2. 取5ml 琼脂均匀铺在载玻片上
凝固
3. 在琼脂板上打5个孔
4. 在孔中加入相应样品 5. 37℃, 孵育24h
7
4. 预期结果
上清 清亮 轻度混浊 中等混浊 混浊 与对照相同
沉淀 大的凝集块 大多凝集管底 小、部分凝集块 很小的凝集颗粒 无凝集现象
凝集程度 ++++ +++ ++ + -
8
管底沉淀 凝集程度
最高稀释比例
待测血清的滴度
9
Test 2 沉淀反应
——琼脂扩散实验
10
沉淀反应:
➢ 经典抗原抗体反应的一种。
制备绵羊红细胞溶液20%、 25%、30%、40%
取0.1ml 皮下注射
免疫小鼠
18
素材和资料部分来自 网络，如有帮助请下载!
➢
+
可溶性抗原
➢ 分类:
✓ 琼脂扩散 ✓ 环状沉淀反应 ✓ 絮状沉淀反应 ✓ 免疫电泳
相应抗体
沉淀线或沉淀环
11
➢ 琼脂扩散实验:
✓ 可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例 下形成沉淀线或沉淀环。
✓ 分类:
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量实验
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性实验
凝集反应PPT
1
2
345
67
阴性对照
步骤：
④每管内都加鸡红细胞0.5ml ⑤混匀后放入恒温箱内1.5h，观察结果
1
2
3
4
567
阴性对照
血清稀释倍数：
1:20 1:40 1:40 1:80
1:80 1:160 1:320 1:640 1:160 1:320 1:640 1:1280
方 法：
①拿出七只试管标号； ②用玻璃吸管在每管内都加生理盐水0.5mL；
实验内容
一、试管凝集实验（半定量） 二、玻片检测实验（定性）
实验目的
掌握：直接凝集反应的原理；抗体 效价的判定 熟悉：血型检测方法 了解：凝集反应的应用
一、试管凝集试验
抗原、抗体在试管中反应故名试管凝集 试验，帮助诊断疾病兔细。抗胞鸡抗红体 原鸡理红：细取胞 待检血清倍比稀释后，加入某种 己知抗原，测定血清中有无相应抗体及其 抗体效价。属于半定量试验。 抗体效价的判定：产生明显凝集反应（++）
玻片凝集试验为定性试验方法。 原理：用已知抗体作为诊断血清，与受检颗粒抗原 如菌液或红细胞悬液各加一滴在玻片上混匀，数分 钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒凝集的为 阳性反应。
此法简便、快速，适用于从病人标本中分离得到 的菌种的诊断或分型，还用于红细胞血型的鉴定。
实验器材：
• 酒精、消毒棉棒、采血针、双凹玻片、记号笔、 牙签、废物缸； • ABO、Rh血型诊断试剂。
实验方法：
抗A
抗B
抗D
结果判定：
• 若在玻片凹孔中出现凝集反 应，可见红细胞凝集成团， 即可见到呈红色点状或小片 状凝集块浮起；
• 若无凝集反应出现，红细胞 散在均匀分布于诊断血清中；
医学免疫学实验之凝集反应和沉淀反应课件16页PPT
类风湿因子的检测
Normal serum
Patient’s serum
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Macroscopic agglutination of latex(乳胶颗粒) coated with human IgG serum from a patient with rheumatoid arthritis.
梅毒快速血清反应素RPR试验
1、4孔加AFP阳性对照 2、3、5、6孔加待检血清
3. 置于湿盒，37C 24h
•结果下周观察
学号
1
6
2
5
3
4
抗AFP抗体
对流免疫电泳检测血清中AFP
• 1、3孔加抗AFP抗体
+
• 2孔，AFP阳性对照血清
1
• 4孔，待检血清
3
pH 8.6巴比妥缓冲液
2
-
4
第2次 凝集反应与沉淀反应
1. 试管凝集（操作） 2. 双向扩散（操作）、对流免疫电泳（示教） 3. 抽血（每组一人，下次实验用）
• 肥达反应结果（观察结果注意：勿摇；先看对照管）
- 不凝集 + 小部分凝集，管底小量凝集，上层液体较混浊 ++ 部分凝集，管底部分凝集，上层液体微混浊 +++ 大部分凝集，凝块非全部下沉于管底而是稍有铺开，上层液体澄清 ++++ 完全凝集，管底有边缘不整齐的膜状凝集块，上层液体澄清透明。
沉淀反应 Precipitation Tests
RPR是心脂质（而不是密螺旋体的）梅 毒抗体试验，在疾病初期呈阳性。 将病人血清与炭联心脂质抗原试剂 混合，阳性血清显示凝集抗原颗粒。 (4分钟后观察颗粒凝集）
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单向免疫扩散
2. 双向免疫扩散
【原理】
• 可溶性抗原与抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，两 者各自向四周扩散，若抗原与抗体相对应，两者相遇即 发生特异性结合，并在比例合适处形成白色沉淀线。
• 可以用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体）， 鉴定抗原性物质或免疫血清的浓度、纯度以及比较抗原 之间的异同点。
定义：的条件下，如果两者比例适当， 在一定的温度下经过一定的时间，可以形成肉眼可见的凝 集块，这种现象叫做凝集反应。
凝集反应
直接凝集反应
【原理】 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原在适当电解 质存在的条件下，可以直接与相应的抗体特异性 结合，形成肉眼可见的凝集块。
实验二
Part I 凝集反应 Part II 沉淀反应 Part III 免疫器官的组织结构观察
123
实验内容
• 凝集反应 – 直接凝集反应：玻片凝集
• ABO血型鉴定
• 沉淀反应
– 环状沉淀 – 琼脂扩散技术：单向免疫扩散、双向免疫扩散 – 电泳技术：对流免疫电泳实验
• 免疫器官的组织结构观察
Part I 凝集反应
• 皮质区 浅皮质区（非胸腺依赖区）：B细胞区（淋巴滤泡） 深皮质区（胸腺依赖区）：T细胞、M 、内皮细胞
• 髓质区 髓索：B细胞，浆细胞，部分T细胞和M 髓窦：大量M
2. 淋巴结（lymph node） 淋巴结皮质
被膜 淋巴小结 被膜下淋巴窦
深（副）皮质区
2. 淋巴结（lymph node）
对准序号加样
3. 对流免疫电泳试验
【原理】
• 在双向免疫扩散基础上加电泳的方法。 • 带电胶体颗粒在电场中移动的方向与其所带电荷有关。
抗原在pH8.6的缓冲溶液中带负电荷，由阴极向阳极移 动。抗体为球蛋白，只带微弱的负电荷，分子量又大， 因为电渗作用反而向负极倒退。 • 抗原与抗体在琼脂两孔间相遇时，在两者比例适当处形 成白色沉淀线。
抗原、抗体在电场中定向移动，被限制了多方向自由扩 散的倾向，因而提高了实验敏感度，且沉淀线出现较快， 可在1小时之内观察结果，所以可用于快速诊断。
【实验器材】
1. 0.05mol/L，pH8.6巴比妥缓冲液。 2. 抗AFP血清，已知AFP阳性血清，待检血清。 3. 玻片、吸管、打孔器、微量移液器、电泳仪等。
【原理】
1. 单向免疫扩散
将某种特异性抗体混合于琼脂中，再于含抗体的琼脂板上 打孔，将一定量的抗原加入孔中。孔中抗原向四周呈辐射 状扩散。若抗原与已知抗体相对应，在两者比例适合处即 出现由IC所形成的沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。
此实验属于定量实验。主要用于测定血清IgG、IgM、IgA 和补体成份的含量。
实验报告
1. ABO血型鉴定的原理、步骤、结果、分析； 2. 对流免疫电泳实验的原理、步骤、结果、分析； 3. 绘制免疫器官（胸腺、淋巴结、脾脏）的镜下观察结果。
（HE染色 观察倍数）
值日
请排好值日生，清理实验桌面，打扫实验室卫生。
下次实验内容
• 补体参与的实验----免疫血清的制备与应用（三）
2、每组同学归纳整理一份预习报告，可以是word电子文档打印，宋体、 小四号、1.5倍行距，2000字左右。
3、每位同学都要查资料，小组成员共同完成。
The End Thank You
免疫器官的种类 中枢免疫器官：胸腺，骨髓，法氏囊（鸟类） 外周免疫器官: 淋巴结，脾脏
法氏囊（Bursa of Fabricius）
免疫器官
1. 胸腺（Thymus）
胎儿胸腺
成人胸腺
1. 胸腺（Thymus）
小叶间隔 皮质
髓质 胸 腺 （HE染色， 10×10）
2. 淋巴结（lymph node）
– 补体溶血反应 – 补体结合实验
• T细胞数量及其功能检测
– 淋巴细胞的分离与纯化 – E花环形成实验 – 淋巴细胞转化实验
预习报告
临床案例 患者陈×，男性，30岁，未婚。自述有静脉注射毒品史2年余，1年前体重明显减轻、 近3月发热、干咳，因近日自感觉呼吸不畅，并伴进行性视力下降，到医院就诊。 体格检查：腿部及手臂皮肤多个紫褐色结节，直径约lmm至lcm大小不等、触痛； 口咽部白膜合并溃疡；全身浅表淋巴结肿大；肺部可闻及干啰音。眼底检查显示视 网膜动脉充血、视乳头水肿出血。胸片显示肺门周围间质性肺浸润。支气管肺泡灌 洗液中可见成团微生物，银染阳性。HIV抗体阳性。CT扫描轻度脑萎缩。口腔涂片 发现念珠菌。HIV mRNA水平为20 000拷贝／m1。 临床诊断：艾滋病。 问题：该病人需要检测T淋巴细胞的数量和功能，可以用哪些方法进行测定？并简 述其原理。 要求：1、可以查阅资料获得检测T细胞数量、功能的方法。（至少2种方法）
【实验器材】
1. 抗A 、抗B标准血清、生理盐水； 2. 塑料板、采血针、试管、滴管、消毒棉棒、牙签、
记号笔等。
【实验步骤】
注意事项 1. 消毒处干燥后再取血 2. 滴管不可与抗体液面接触 3. 不可用牙签的同一头混合液体
红细胞血悬1液滴 NS 5滴
抗A 1滴
抗B 1滴
A
B
红细胞悬液 1滴
【实验结果判断】
髓窦 髓索
淋巴结髓质
3. 脾（spleen）
3. 脾（spleen） 脾脏的基本结构:白髓
3. 脾（spleen） 脾脏的基本结构:红髓
小结
抗原抗体检测：特异性、可见性
1. 凝集反应：颗粒性抗原 直接凝集反应 玻片凝集----定性
2. 沉淀反应：可溶性抗原 定性：双扩、对流免疫电泳（双扩＋电泳） 环状沉淀 定量：单扩
抗体
抗原
可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体），鉴定抗原 性物质或免疫血清的浓度、纯度以及比较抗原之间的异同点。
【实验步骤】
1
6
2
1 62
53 4
24h
53 4
⑴ 中央 孔：抗体（AFP诊断血清）。 ⑵ 1、4孔：阳性对照（AFP阳性血清）；
2、3、5、6孔：相应待检抗原。 ⑶ 放入湿盒内，24h后检查结果。
血型 抗A血清
抗B血清
A型
B型
AB型
O型
【原理】
Part II 沉淀反应
可溶性抗原（多糖、蛋白质、类脂等）与相应抗体特异性结 合，在电解质存在的条件下，如果两者比例适当，在一定的 温度下经过一定的时间，可以形成肉眼可见的沉淀物，这种 现象称为沉淀反应。
【分类】
• 环状沉淀 • 免疫扩散技术：双向免疫扩散、单向免疫扩散 • 电泳技术：对流免疫电泳、免疫电泳、火箭免疫电泳
【实验步骤】 电极＋
－电极
1
2
34
1
2
34
抗AFP血清 抗AFP血清
Ab
Ab
已知阳性血清
Ag
待检血清
电极＋
－电极
1
2
？ 3 4
1
2
？ 3 4
抗AFP血清 抗AFP血清
Ab
Ab
已知阳性血清
Ag
待检血清
Part III 免疫器官的组织结构观察
免疫系统：机体执行免疫应答和免疫功能的重要系统。
免疫器官----骨髓、胸腺、淋巴结、脾脏等； 免疫组织----淋巴小结、弥散的淋巴组织等； 免疫细胞----T细胞、B细胞、NK细胞等； 免疫分子----抗原、抗体、细胞因子等。
【分类】
玻片凝集 ABO血型鉴定
ABO血型鉴定
人类ABO血型系统
【原理】
人类ABO血型抗原分A、B两种。A型血者红细胞膜上有 A抗原，B型血者红细胞膜上有B抗原，AB型有A、B两种抗 原，O型则不含A、B抗原。
用已知的抗A或抗B试剂与受检者红细胞混合时，抗A和 /或抗B血清与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝 集，根据其凝集状况便可判定受试者的血型。