噬菌体的分离与纯化

大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化
【实验目的】
1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。

2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。

3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。

4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。

5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。

【实验原理】
1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。

粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。

2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：
（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；
（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；
（3）将样品内的细胞进行富集培养；
（4）制备噬菌体裂解液；
（5）检测噬菌体是否存在；
（6）噬菌体的纯化及效价测定。

3.培养基的配制（配方）与灭菌
（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：
牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.
（2）牛肉膏蛋白胨培养液：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.
（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。

（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。

封好做好标记于121℃灭菌20min备用
【实验材料及器皿】
1.菌种：大肠埃希氏菌。

2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水
3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。

4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。

【实验方法步骤】
第一周：实验方案的讨论与完善
第二周：培养基的配制及相关实验器材的灭菌
牛肉膏蛋白胨固体培养基100ml，并取三个试管各加入3—4ml以搁斜面保留菌种
3X牛肉膏蛋白胨培养液50ml，装小三角瓶内
牛肉膏蛋白胨培养液100ml分装到5个大试管中，每管9ml，并依次标记10-5—10-1，剩余的装试管做好标记
离心管12个（包好）
无菌水2管（3—4ml每管）
玻璃涂布器3个（包好）
将以上物品包好、做好标记，于121℃灭菌20min，对3个牛肉膏蛋白胨固体培养基搁斜面。

第三周：
周日下午
1. 接菌种：将大肠杆菌接种于搁号的斜面上（保留菌种）
2. 大肠杆菌的活化：挑取一环大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，（试管中）
3. 将大肠杆菌和敏感菌悬液于37℃恒温培养18h,备用。

周一中午
4. 取上述敏感菌培养液6ml至盛有50ml 3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养6h。

5. 将大肠杆菌菌种和剩余敏感菌培养液置于4℃冰箱保存备用。

周一晚上
6. 加污水100ml至敏感菌培养液和3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养。

周二晚上
7. 制备裂解液：将以上增殖的混合培养液用2500r/min 离心30min,取上清液
8. 将上清液再次用2500r/min 离心15min,取上清液4℃保存备用。

9. 融化固体培养基、倒平板3个，先在平板表面滴加培养至对数期的大肠埃希氏菌菌液数滴，用无菌涂布棒涂匀。

带菌被平板培养基吸干后，在其上滴加上述上清液5-7滴于含菌平板表面，同时在同一平板的某区域上滴加无菌水对照。

10.将平板倒置于37℃恒温培养。

11.配置牛肉膏蛋白胨半固体培养基50ml，并按3.5ml每管分装到5个试管中，做好标记于121摄氏度灭菌20min。

周三下午：
12.观察平板，验证污水中是否有噬菌体（实验现象、结果见后面分析）
第四周：
周二晚上：
1、噬菌体样品的稀释：将已证明有噬菌体的上清液用牛肉膏蛋白胨培养液依次稀释为10-1，10-2，10-2，10-4，10-5 5个稀释度。

2、倒底层平板：取无菌培养皿5只，每个培养皿倒入约10ml牛肉膏蛋白胨琼脂培养基作底层，依次标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5稀释度。

3.制备上层混合液：制备噬菌体与敏感菌混合液，即在标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5共5支无菌试管中分别各加入0.2ml培养至对数期的大肠杆菌菌液，然后在各对应试管中加入相应稀释度的噬菌体液0.1ml后混匀，37℃保温5min，带噬菌体吸附侵入寄主细胞。

4.倒上层半固体琼脂平板：在上述各噬菌体和敏感菌的混合管中各加入3.5ml约50℃左右的上层牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基，立即摇动试管使培养基与菌液充分混匀，并对号倒在含有底层琼脂平板的表面，迅速铺平待凝。

5.培养：待上层琼脂凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱中培养。

周三下午：
6.观察实验结果（具体结果见后面分析）
7.清洗整理实验用具。

【实验结果及分析】
1.大肠杆菌斜面结果：“z”型线清晰均匀，斜面结果较好。

分析：（1）培养基、斜面灭菌彻底，无杂菌生长。

（2）操作时严格按照斜面接种的方法进行。

2．验证噬菌体的存在的平板结果：
一、用枪加裂解液的平板（1个）：中央有大面积的透明区，周围有小部分的菌膜
二、用接种针加裂解液的平板（2个）：平板上出现明显的噬菌斑：透明，约8mm左右的圆形噬菌斑，对照区域无噬菌斑。

分析：
一、因所用的枪的最小量程为0.1ml，所以用枪加裂解液量过大，以致大面积的区域没有大肠杆菌，但周围有部分菌膜，说明有噬菌体存在，但既无噬菌斑有无对照，说服力不够强。

二、（1）平板上有噬菌斑，对照区无噬菌斑，充分证明所取材料中有噬菌体存在
（2）验证噬菌体存在时，滴加裂解液的量不宜过多，以免影响结果的观察从而影响判断。

3.噬菌体纯化的平板结果
平板表面没有成片的菌膜，也没有噬菌斑，但有分布基本均匀、为数不多的菌苔：呈直径约1mm左右的淡黄色圆形（5个平板现象一致）
分析：
（1）在验证噬菌体是否存在时，出现了明显的噬菌斑，证明所取材料中有噬菌体存在，噬菌斑的周围是大肠杆菌菌膜，同时也说明敏感菌悬液浓度合适。

（2）平板表面有少量菌苔，而前面已证明敏感菌悬液浓度合适，不是很低，说明有部分大肠杆菌死亡，而无噬菌斑出现，既说明死亡大肠杆菌不是噬菌体所致，也说明噬菌体死亡，所以应在操作步骤中找原因。

（3）在倒上层平板这一步中，半固体培养基在电炉上水浴融化后置于50℃的水浴锅保温，由于其他操作已经完成，实验时不够严谨，保温时间过短，大约3分钟就拿出来，直接加到上层混合液中，刚刚煮沸的半固体培养基在50℃的水浴锅中放置3分钟不足以使其自身温度降低至50℃左右，高温烫死了几乎所有的噬菌体和大部分的大肠杆菌，只有少数大肠杆菌存活了下来。

【实验心得】
由于不够严谨，致使实验结果不尽如人意，后续的实验，我们没再进行，说实话有点“不甘心”。

但本次综合实验意义重大，我收获不少，通过自己查阅资料、自己整理实验方案、自行安排并完成实验，使我对微生物甚至生物学实验有了系统的了解，通过具体的实验过程，更深入的掌握微生物学实验的基本原理和操作方法，培养自己的无菌意识，在今后的实验中应更加细心严谨，不断进取。