大规模细胞培养与细胞工厂
《园艺植物育种学》复习大纲
阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。
——培根《园艺植物育种学》复习大纲绪论一、内容提要：选育园艺植物新品种是发展园艺生产的关键途径之一。
各种各样的栽培园艺植物种类及其品种类型都是从野生植物进化而来。
利用园艺植物的自然变异和人工创造变异并进行人工选择的进化就是优良性、适应性、稳定性和整齐性，品种具有特异性等特性。
良种是在适应的地区，采用优良的栽培技术，能够生产出高产、优质，并能适时供应产品的品种。
它有提高单位面积产量、改进产品品质、提高抗病虫害能力以减少农药污染、增强适应性和抗逆性以节约能源、延长产品的供应和利用时期，适应集约化管理、节约劳力等多方面的作用。
园艺植物育种学是研究选育与繁殖园艺植物优良品种的原理和方法的科学，是以遗传学、进化论为主要基础涉及多门学科的综合性应用科学。
它研究的任务是根据遗传变异的规律，合理选择利用种质资源，通过发现和创造变异来选择优良品种，以及提高种性、防止混杂退化、加速良种繁殖的原理和方法。
园艺植物育种有着悠久的历史。
19世纪才有专门的育种机构，20世纪育种理论、方法进步很快，新品种选育成果巨大。
二、思考题：1、了解品种的概念及其属性；2、良种在园艺植物生产中的作用？3、自然进化与人工进化的区别？4、园艺植物育种学的任务和内容？第一章育种对象与目标一、内容提要园艺植物多为周期长的多年生植物，育种年限长，育种目标涉及产量、品质、熟期及抗性等一系列目标性状。
因此，因地制宜选择育种对象，明确育种目标，制订育种方案，是育种工作成败的关键。
二、思考题：1、当前园艺植物育种的总目标是什么？2、园艺产品的品质按产品用途和利用方式大致可分为哪几种？3、制订育种目标的主要根据和原则是什么？第二章园艺植物的繁殖习性、品种类别和育种方法园艺植物繁殖方式不同，其遗传特征就不一样，因而相应采取的育种程序和方法也不同。
此外，栽培植物品种根据其群体遗传组成，可分为自交系品种、群体品种、杂交种品种和无性系品种。
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术简介大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(rollerbottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。
第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。
随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
动物细胞大规模培养 ppt
目前, 大规模动物细胞培养中已经普遍使用 无血清培养基, 在此之前使用过天然培养基、 合成培养基。无血清培养基避免了血清培养基 污染的可能性, 并减少了纯化的难度。 但无血 清培养基没有广泛的适应性, 不同的细胞甚至 不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血型培 养基配方。采用无血清培养而诱发细胞凋亡也 成为动物细胞无血清培养技术中急待解决的问 题。在培养基中加入某些化合物, 如金精三羧 酸(ATA )、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等, 在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导 致的细胞凋亡。
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贴壁培养细 胞转瓶机
2、贴壁培养的优点：
●容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。 ●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的
目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
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三.生物反应器分类
按其培养细胞的方式不同，可分三类：
1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中 空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、 气升式反应器； 2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微 载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反 应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器； 3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、 固化床反应器。
2、共价贴附法: 利用共价键将动物细胞与固相载体结合的 固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏， 但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因 贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。
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第十二动物细胞的大规模培养技术
第十二动物细胞的大规模培养技术大规模培养哺乳类细胞是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种有效的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，推动了生物学和医学的发展，给医学卫生事业带来了巨大的社会效益和经济效益。
基因工程技术、细胞工程技术，以及新的细胞大规模繁殖培养系统的发展，是构成上述成就的主要原因。
然而，体外大规模繁殖真核细胞要比原核细胞困难得多，如细菌、酵母菌和霉菌的细胞壁厚，能耐受搅拌，不易破碎，营养要求低，生长条件易于控制，增殖周期短，产品的产量也高，目前国外已用20万L发酵罐进行生产。
而真核细胞膜薄而娇嫩、易碎，对营养要求高，大多数细胞必须贴壁附着生长，更重要的是真核细胞具有原核细胞所没有的功能，能对其分泌产物进行修饰，例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整的生物学功能，另外原核细胞经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程复杂，而使产品的得率受到损失。
利用真核细胞，可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对简单，而且细胞往往可以重复利用。
因此，利用培养的动物细胞生产的生物制品，仍有很高的市场价值。
实验室常规培养动物细胞的方法是用人工合成培养液加上一定量的小牛血清，将细胞放在不同的容器中进行培养，如微孔板、培养皿以及各种培养瓶等。
一船培养容器的体积很小，最大培养体积为1—2L。
用这种方法培养的细胞所分泌的产物是有限的，无法满足实验研究和应用研究的需要。
利用小鼠腹水法繁殖杂交瘤细胞生产各种单克隆抗体；虽然能获得较高浓度的单克隆抗体，一般每只小鼠腹水单克隆抗体浓度在10mg／m1左右，但不易控制动物的批间差异和非特异的小鼠免疫球蛋白，以及潜在感染因子的污染。
单克隆抗体纯度差，分离纯化难度大，成本不低，又不宜用于人体内的诊断和治疗。
因此，不可能作为大规模生产单克隆抗体的主要方法。
应用细胞工程技术，建立大规模细胞培养系统生产各种生物活性物质，是一种比较经济可靠的技术。
细胞大规模培养
主要操作步骤
先镜检培养物，观察细胞的接种密度 在超净工作台内进行操作，将培养用液瓶口用75％酒精消毒， 倒掉培养细胞的旧培养基。用D-PBSA溶液进行清洗，再在 培养瓶中加入适量0.25%胰蛋白酶消化，放入CO2培养箱一 分钟。盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当在显微镜下见细 胞质回缩，胞体收回突起变圆，细胞间隙增大时立即翻转培 养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，加培养液终止消 化。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。(若胰酶中加有 EDTA还得加入2到3mlHanks液，轻轻转动培养瓶，以冲掉 残余消化液中的EDTA，弃去Hanks液） 加入少量的含血清的新鲜培养基，轻轻反复吹打消化好的细 胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的 新鲜培养基制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶 盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养 瓶放回CO2培养箱
注意事项
吸取细胞悬液时，需注意无菌操作，应在超净工作 台内使用微量移液器套装无菌吸嘴进行操作 用0.25%胰蛋白酶消化时，注意勿使细胞提早脱落 入消化液中 计数时，应先将细胞悬液混匀再计数
显微镜下观察细胞的汇合度情况
第二天
第三天
第四天
种子细胞扩大培养数据分析
培养天数 培养容器 培养容器用量 培养体积
复苏的注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快， 可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损 的温度段(-5～0℃)。 离心强度不宜过大，避免对细胞的损伤。
二、种子细胞的扩大培养
为了获得足够接种生产罐所需的细胞，需要进行连 续的扩大培养。 镜检培养物，确认汇合度是否接近或达到100％； 无菌操作，消化、收集细胞（用0.25 ％ 胰蛋白酶 消化） 目的是为了满足1000L细胞种子罐接种需求，要求 密度不低于5×104/ml ，那么总细胞数则不应低于 5×105 依据生产用细胞罐的培养体系的体积数和生长罐内 细胞接种的起始密度，即可计数出所需种子细胞的 总数
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（细胞工程）名词解释
一、名词解释细胞工程:是应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。
通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。
外植体:是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。
植物组织培养：（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
（狭义）组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。
胚状体〔embroid〕:—对应于胚〔embryo〕，在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。
离体无性繁殖：是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。
跟常规的繁殖方法相比它是一种微型操作过程，因此，有时就直接称之为微繁继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。
细胞分化:指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
细胞脱分化:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。
细胞再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。
人工种子:亦称体细胞种子。
早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮包被后而形成的体细胞种子。
现在指任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。
植物细胞全能性:指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。
大规模细胞培养技术的操作方式
大规模细胞培养技术的操作方式规模细胞培养的操作方式可分为：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式五种。
一、分批式培养（batch culture）分批式培养（batch culture）是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；直观反映细胞生长代谢的过程。
因培养期间细胞生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反映细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；可直接放大。
由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式培养操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。
分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。
分批培养的周期时间多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。
收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。
二、流加式培养（feeding culture）1.流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
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细胞厂
• 用于大规模细胞培养与生产
细胞工厂
关键技术： 贴壁处理：高真空等离子接枝表面处理（ know-how: 接枝材料与接枝技术） 材料性能：生物相容性（无细胞毒性） 多层焊接技术：密封性与牢固性 灭菌技术：Y射线辐照
细胞工厂品牌
• 国外：美国Nunc; 美国Corning • 国产：北京DHS（引进国外技术）
细胞工厂的实验室应用：替代培养瓶及 多层培养瓶
细胞培养的评价
• • • • 贴壁率 细胞生长密度 细胞形态 毒力测定
生物制药
• 交流：zhonglm@
贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面 才能生存的细胞
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
细胞贴附材料与表面
贴附的固相表面材料：玻璃、塑料（聚苯乙烯） 玻璃：本身具有亲水性，适于细胞贴壁
塑料：没有亲水性，不能使细胞贴壁，所以必须在 塑料表面进行亲水性接枝（等离子处理）
大规模细胞培养
1.细胞培养反应器 2.转瓶培养 3.细胞工厂
转瓶培养的缺点
• 转瓶技术为传统的贴壁细胞培养技术，细胞接种 在旋转的圆筒形培养器-转瓶中，培养过程中转瓶 不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气。 • 缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供 细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，瓶间差 异较难控制等，因而难以产业化或规模化生产。 • 重要的是：转瓶由于不是静止培养，产品质量经 常达不到要求或由于细胞易破碎而存在DNA毒性 潜在危险，据称国家准备淘汰转瓶生产技术。
（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离
Corning CellSTACK Chamber
三种细胞工厂的比较
• 材料：均为PS塑料 • 表面处理：各自的Know-how • 顶层：DHS同Nunc, 便于显微镜观察细胞 生长情况 • 焊接工艺：Nunc采用超声焊接，Corning采 用特殊胶粘接，Corning的更加牢固（不易 开裂），DHS采用粘接工艺 • DHS可以定制任意层的细胞工厂
悬浮生长型细胞
悬浮培养磁力搅拌器
常用生产用细胞
• BHK-21细胞、C127细胞、CHO-K1细胞 、COS细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞 、Namalwa细胞、sf-9细胞、Vero细胞、 WI-38细胞、鼠骨髓瘤细胞、SP2/0-Ag14 细胞
细胞库的建立
• 按我国和美国FDA的规定，用于生产的工 程细胞必需建立两个细胞库：原始细胞库 （master cell bank，MCB）和生产用细胞 库（manufacturer's working cell bank， MWCB）或称工作细胞库（working cell bank，WCB）
内容
• 一）什么是细胞工厂 • 二）细胞工厂的应用 • 三）几种细胞工厂的比较
细胞工厂的概念
• 实验室细胞培养：培养瓶、培养皿等 • 实验室较大量培养：多层培养瓶、1-5层细 胞工厂 • 大规模细胞培养：反应器、转瓶、细胞工 厂
我们熟知的细胞培养——动物细胞培养
动物细胞培养技术
1）无菌环境：超净台、安全柜 2）生长环境：CO2培养箱 3）营养环境：培养基 4）贴壁环境：培养瓶（皿）等、细胞工厂
DHS 细胞工厂
• 国内第一家引进国外技术生产的细胞工厂
Nunc Cell Factory
Corning CellSTACK Chamber
Choice of traditional surface treatment(TC), new Corning® CellBIND® Surface for enhanced cell attachment, or UltraLow Attachment Surface for reduced cell attachment
（一）贴附型：
大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞
贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本 存在方式 结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组 织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生 存和生长。 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附 于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞
动物细胞的形态
• 贴壁细胞：细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，依 靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上 生长、增殖，当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态
，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型
• 悬浮细胞：悬浮状态生长，如淋巴细胞、Namalwa细胞 • 兼性贴壁细胞：中国仓鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞