动物细胞培养技术实验
动物细胞操作实验步骤
一、实验目的1. 熟悉动物细胞培养的基本原理和操作技术。
2. 掌握动物细胞传代、冻存、复苏等基本操作方法。
3. 了解动物细胞在生物学研究中的应用。
二、实验原理动物细胞培养是将动物组织或细胞在体外模拟体内环境条件下，进行生长、繁殖的一种技术。
通过动物细胞培养，可以研究细胞生物学、分子生物学、遗传学等方面的知识，为生物医学研究和药物开发提供实验材料。
三、实验材料1. 细胞：小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠胚胎肺细胞等。
2. 培养基：DMEM、RPMI-1640等。
3. 培养试剂：胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等。
4. 仪器：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机、水浴锅等。
四、实验步骤1. 细胞复苏（1）将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37℃水浴锅中解冻。
（2）用移液器将细胞悬液转移至离心管中，1000g离心5分钟。
（3）弃去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。
（4）将细胞悬液转移至培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. 细胞传代（1）将培养至80%汇合度的细胞取出，用胰蛋白酶消化。
（2）将消化后的细胞悬液转移至离心管中，1000g离心5分钟。
（3）弃去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。
（4）将细胞悬液按1:2或1:3的比例传代至新的培养瓶中。
（5）置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
3. 细胞冻存（1）将培养至70%汇合度的细胞取出，用胰蛋白酶消化。
（2）将消化后的细胞悬液转移至离心管中，1000g离心5分钟。
（3）弃去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。
（4）将细胞悬液按1:1的比例转移至冻存管中。
（5）加入10%DMSO，混匀。
（6）将冻存管置于-80℃冰箱中过夜，然后转入液氮罐中保存。
4. 细胞观察（1）将培养好的细胞取出，用胰蛋白酶消化。
（2）将消化后的细胞悬液转移至载玻片上，滴加适量固定液。
（3）室温固定10分钟。
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
动物细胞培养技术
动物细胞培养技术动物细胞培养技术是生物学领域中的一项重要技术，它可以帮助科学家们研究动物细胞的结构、功能和生理过程。
通过培养动物细胞，科学家可以模拟生物体内的生理环境，从而更好地理解细胞的生物学特性。
本文将介绍动物细胞培养的基本原理和常用的培养技术。
一、动物细胞培养的基本原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出并在体外特定的培养基中进行培养的过程。
培养基是一种模拟生物体内环境的营养液，它提供了细胞所需的必要营养物质和生长因子。
在培养基中，细胞可以获得适当的营养和生长条件，从而保持其生物学特性并进行增殖。
动物细胞培养的基本原理包括以下几点：1. 细胞来源：细胞可以来源于动物组织、器官或体液中，常用的细胞来源包括胎儿组织、胚胎组织、肿瘤组织等。
2. 细胞分离：细胞从组织中分离的方法通常包括机械分离、化学分离和酶解分离。
分离后的细胞可通过离心等方式得到单个的细胞悬液。
3. 培养基选择：根据细胞的特性和要求，选择合适的培养基。
培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基，无血清培养基常用于细胞实验室中。
4. 细胞培养条件：通过调整培养温度、湿度、pH值、氧气含量等条件，提供合适的环境促进细胞的生长和增殖。
5. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，需要进行细胞传代以保持其活力。
传代的方法通常是将细胞分散至新的培养容器中，以维持细胞的适宜密度。
二、常用的1. 无血清培养技术：无血清培养基是一种不含胎牛血清的培养基，通过添加人工合成的生长因子和营养物质来满足细胞的生长需求。
无血清培养技术避免了胎牛血清中含有的未知因子对实验结果的干扰，提高了实验的可重复性。
2. 原代细胞培养技术：原代细胞培养是将从动物体内直接获得的组织进行分离和培养。
这种方法可用于细胞的初次培养和研究。
但由于原代细胞在培养中只能进行有限的传代，其使用寿命较短，因此需要定期重新取材。
3. 细胞系的建立：细胞系是细胞通过传代培养，并保持了一定生物学特性和遗传稳定性的细胞群。
高中生物课程教案分享：动物细胞培养实验案例讲解
高中生物课程教案分享：动物细胞培养实验案例讲解导言生物学是指研究生物体及其相互关系和运动规律的学科，其内涵包含了多样性、相互作用、进化和适应性等。
而生物学课程不仅是学生学习生物学或进一步攻读医学或生物科学的必要前提，更是一种较为全面的自然科学。
在生物课程的教学中，神经元和细胞、遗传学、免疫学等学科是不容忽视的重要内容之一。
在其中，细胞学更是贯穿整个课程的核心。
教学目的细胞培养实验是细胞学领域一个常见的实验技术，使用这种技术，我们可以在实验环境下研究细胞的许多功能和过程。
这一实验的教学目的包括：1.理解细胞培养的重要性和运作原理；2.学习如何准备培养基及其配制方法；3.学会样本准备和理解细胞培养的基本技能；4.掌握无菌操作和安全措施。
教学过程实验材料1.细胞培养基（DMEM）；2.无血清胎牛血清（FBS）；3.法尼迪胆红；4.表面活性剂（如Tween 20）；5.96孔板。
步骤1：样品收集洗涤细胞样品及其培养。
为保证实验能够顺利进行，必须使用无菌技术并避免感染风险。
在进行收集样品作业前，务必洗手及其消毒，并在时期内保持反复按照。
此外，需要准备完整的实验平台及其消毒设备，如消毒液、眼罩、手套、口罩等。
步骤2：试管准备收集样品后，需要将其移动至已经清洗和消毒的环境中。
此时，必须通过微生物循环柜和干燥器来消毒以及干燥工具和表面。
之后，Proceed to add the culture medium, FBS,and penicillin-streptomycin combination.在处理试管时使用无菌循环柜，紧挨着清洁过的手套将保存期点的细胞样品注入，使其均匀分布于试管中。
步骤3：细胞培养在培养过程中，需要定期观察其细胞的生长状况和替换细胞培养基。
此外，还需要为细胞提供必要的营养物质和环境因素。
在这些位置，需要进行的步骤如下：1.使用微量注射器在试管里添加保护培养基和抗生素，确保细胞的生存和稳定；2.在试管上方贴上无菌膜，不仅可以保护试管和培养基，还能增加细胞的纯度和稳定性；3.将试管在配备好了的細胞培養箱中放置，在恒温孵育器上设置适宜的温度、湿度和氧气供应，确保试管保持稳定和深度。
动物细胞培养实验2
实验题目：动物细胞培养教师：XXX实验类型：综合学时：26(参考)内容：一、实验目的通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。
初步掌握无菌操作的基本原则，认识无菌操作在细胞培养中的重要性。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外生长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌操作。
三、试剂与器材1.材料出生后2-3天的乳鼠2.试剂平衡盐液－Hank液细胞消化液 0.5%水解乳蛋白-Hank液犊牛血清碳酸氢钠 1万单位/ml青、链霉素 3%谷氨酰胺磷酸盐缓冲液3.实验器材镊子解剖刀剪眼科剪眼科镊纱布块玻璃漏斗量筒记号笔试管试剂瓶三角瓶移液管培养皿培养瓶吸管橡皮头显微镜血细胞计数板计数器酒精灯酒精棉球试管架试管解剖板碘酒棉球口罩二氧化碳培养箱超净工作台灭菌锅倒置显微镜四、实验内容原代培养：取肾→消化分散组织→计数与稀释→分装培养→观察。
传代培养：配置培养液→消化细胞→细胞计数→培养观察。
培养细胞冷冻保存。
五、关键步骤及注意事项1. 注意无菌操作，及时更换培养液。
六、思考题1. 简述细胞传代培养的操作程序注意事项？2. 细胞培养获得成功的关键要素是什么？3. 简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。
动物细胞培养实验方案
动物细胞培养实验方案一、实验目的：1.掌握动物细胞的培养技术；2.了解动物细胞的生长特点和培养条件要求；3.学习观察和分析动物细胞的形态变化和生长状态。
二、实验器材与试剂准备1.器材：细胞培养器皿（如培养皿、蜡烛罩、CO2培养箱等）、离心机、显微镜、细胞计数板、计时器等；2.试剂：细胞培养基、培养液添加剂（如酶、抗生素等）、PBS缓冲液、生长因子、染色剂等。
三、实验步骤1.细胞培养基的配制：按照制定的配方将培养基粉末加入适量的无菌去离子水中，搅拌均匀后，进行高温高压灭菌，冷却后分装至培养器皿中；3.细胞处理和接种：将收集到的组织先用PBS缓冲液洗涤，然后使用细胞裂解酶或胰酶等消化酶消化组织，使细胞分散，处理成单个细胞后，用细胞计数板计数，并将细胞悬液接种到预先准备好的培养器皿中；4.细胞培养条件的控制：将培养器皿置于CO2培养箱中，设定适当的温度（通常为37℃）、湿度和CO2浓度（通常为5%），并保持稳定；5.细胞培养的观察和记录：观察培养皿中细胞的形态变化和生长状态，记录细胞的外观、增殖情况、易于观察的指标等；6.细胞的子培养和冻存：当细胞达到一定密度时，可以进行子培养，即将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中，以促进细胞的增殖和保存细胞生物资料。
此外，也可以将分散的细胞加入由培养液和冻存剂组成的试管中，通过冷冻的方式保存细胞，并用于后续的实验。
四、实验控制与常见问题的解决1.环境控制：细胞培养箱中的温度、湿度和CO2浓度的调整应尽量保持稳定；2.培养基的配制：根据细胞培养物的不同，可以选择不同配方的培养基，确保培养基的质量符合要求；4.洗涤步骤：组织或细胞的洗涤步骤应轻柔，避免对细胞的损伤；5.细胞的接种量：对于粘附性细胞，接种量应适当，以避免细胞过度堆积或过度稀释。
五、实验结果和分析观察培养皿中细胞的生长状态、细胞数量以及形态的变化，记录生长状态、增殖情况和其他可以观察到的指标，并进行数值化分析和统计。
动物细胞培养传代培养
实验三：动物细胞培养细胞传代培养【实验目的】熟练掌握细胞的传代培养法。
【实验原理】传代培养是组织培养常规保种方法之一。
也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。
【材料用品】材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。
药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks 液。
仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。
【实验步骤】1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置37℃下预热。
3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7．倒掉培养细胞的旧培养基。
酌情可用2—3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
18．每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7～10 mL／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。
实验五动物细胞培养与细胞活性检测
学习并掌握数据分析方法，如 统计分析、图表制作等，对实 验结果进行科学合理的解释。
了解药物研发过程中细胞活性 检测的重要性和应用价值，为 后续药物研发提供实验依据和 指导。
02
实验原理
动物细胞培养基本原理
动物细胞培养是将动物细胞在适 宜的条件下进行体外培养，使细 胞在体外继续生长、分裂和维持
生命活动的过程。
药物对细胞活性影响机制
药物对细胞活性的影响是指药物通过与细胞膜上的受体或直接进入细胞内，对细 胞的代谢、信号转导、基因表达等方面产生影响，从而改变细胞的生长、增殖和 凋亡等过程。
药物对细胞活性的影响机制非常复杂，涉及多个环节和信号通路，是药物研发和 药理学研究的重要内容。
03
实验步骤
动物细胞培养准备
05
结论与展望
实验结论总结
实验结果表明，动物细胞在适宜的培 养条件下能够正常生长和繁殖，并且 通过细胞活性检测可以评估细胞的生 长状态和存活率。
细胞活性检测的方法包括染色法、荧 光法、酶活性法等，这些方法可以有 效地评估细胞的生长状态和存活率。
实验中使用的动物细胞培养技术包括 细胞分离、传代、培养基选择等，这 些技术对于保证细胞生长和存活至关 重要。
了解细胞活方法，如MTT法、荧光染色法、 细胞计数法等。
02
了解不同检测方法的原理和应用范围，能够根据实验需求选择
合适的检测方法。
掌握细胞活性检测的实验操作流程，包括样品制备、加药处理、
03
孵育时间等。
分析细胞活性与药物作用的关系
通过实验观察不同药物对细胞 活性的影响，分析药物作用机 制和效果。
培养基是细胞生长的必要条件， 它提供了细胞所需的营养物质、
激素、生长因子等。
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实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。
二. 实验内容1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术；2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术；3.细胞污染检测方法与技术；4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。
三．实验用品1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH试纸、酒精棉球等3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。
四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏1. 缓冲液及培养基配制Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。
4℃下保存。
胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。
MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。
4℃下保存。
Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。
0.22μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。
此为基础培养基。
使用前加入10%胎牛血清。
细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。
PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,pH 7.0, 121℃（15磅）消毒20min。
弱硫酸洗液：重铬酸钾 10g，粗浓硫酸 200ml，水 100ml。
先称取粗制重铬酸钾10g，放于大烧杯内，加普通水100ml使重铬酸钾溶解（必要时可加热溶解）。
再将粗制浓硫酸（200ml）缓缓沿边缘加入上述重铬酸钾溶液中即成。
加浓硫酸时须用玻璃棒不断搅拌，并注意防止液体外溢。
若用瓷桶大量配制，注意瓷桶内面必须没有掉瓷，以免强酸烧坏瓷桶。
配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产生大量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。
2. 培养瓶等玻璃制品的清洗与消毒（1）细胞培养用玻璃制品的清洗包括洗衣粉液浸泡、刷洗、自来水冲洗及酸泡等步骤。
酸泡24小时后，用流水冲洗将酸液完全清洗掉，然后用蒸溜水浸泡和冲洗数次，烘干备用。
注意接触洗液时必须戴防酸手套以防护。
（2）将培养瓶或移液管等分别放入消毒盒或筒中，121℃（15磅）消毒30min，烘干后备用。
3. 细胞培养与传代（以昆虫细胞Tn-Hi5为例）在培养瓶中细胞生长成单层，铺满瓶底时就需要传代了。
传代步骤如下：（1）倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
（2）用0.1％新洁尔灭溶液或70% 酒精擦净超净台台面。
打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
（3）操作前用肥皂洗手，用70％酒精擦拭消毒双手。
（4）点燃酒精灯；将培养瓶瓶口用70％酒精消毒，过酒精灯火焰后放置于酒精灯旁。
（5）在火焰周围打开培养瓶瓶盖，用无菌移液管按比例吸取5~10 mL Grace 完全培养基，小心吸打几次，以将瓶底的细胞吹起混匀，再将细胞悬液均匀分装到新的培养瓶中。
（6）对于贴壁很紧的细胞，先倒掉培养瓶中的旧培养基，再向培养瓶中加入1 mL胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(3～5mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
（7）将传代细胞放到培养箱中， 28℃培养。
每隔24 hr 在倒置显微镜下观察，待细胞又长成单层时再次进行传代。
4. 细胞冻存（1）预先配制冻存液：含20%血清培养基，10% DMSO。
（2）取对数生长期细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。
加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～1×107细胞/ml)。
（3）在安倍瓶或冻存管中加1～1.5 ml细胞悬液，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
（4）将封好的安倍瓶或冻存管置于塑料盒或小袋，以1℃／min 速率进行冷冻，在30～40 min 内使其到达液氮表面，再停30分钟后，将其投入液氮中，-70℃冻存可达数年。
5. 细胞复苏（1）检查冻存记录，确定将要复苏的冻存管的位置。
（2）将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻。
（3）当细胞完全解冻后，用70%乙醇擦拭冷冻管进行消毒，然后在超净台内打开冻存管。
（4）用1ml移液管将解冻后细胞转移到培养瓶中，将培养基缓慢加到细胞悬液中以稀释细胞和保护剂。
（5）将细胞置于28℃培养。
注意在倒置显微镜下观察细胞的生长状态，必要时更换培养基，添加新鲜培养基，直至细胞恢复正常生长状态。
注意：细胞冻存与复苏时需要接触液氮罐中的液氮，请穿实验服并佩戴防护面罩或眼镜以及手套，以免造成机体损伤。
（二）细胞生长曲线测定与细胞活性检测1. 细胞生长曲线测定（MTT法）（1）取对数生长期细胞用血球计数板计数，将细胞密度调整为5×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104等6种浓度分别接种到96孔细胞培养板中，每个浓度接种6孔，共同时接种7板。
28℃培养。
（2）接种24、48、72、96、120、144、168 hr后，各取一个96孔板，在每孔加入MTT 溶液20μL，继续孵育4hr后终止培养，快速翻转96孔板，倒掉培养液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min使蓝紫色甲讃完全溶解，用酶联免疫监测仪检测490nm处吸光值，并以只加培养基而未加细胞的孔为对照调零。
每个浓度取6孔OD值的平均数，实验重复三次。
（3）以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
2. 细胞活性检测（台盼蓝法）（1）取对数生长期细胞制备细胞悬液。
（2）在900uL细胞悬液中加入100 uL 4%的台盼蓝染液，混匀染色5min后，制片观察。
（3）在显微镜下观察，活细胞拒染呈无色，死细胞被染成蓝色。
随机计数视野内死活细胞的数量，计算细胞的存活率。
（三）细胞污染检测方法与技术1. 常见细胞污染类型的初步鉴定细菌污染：短时间内培养基颜色变黄，明显浑浊，在低倍镜下即可见细胞之间空隙处有颗粒物。
真菌污染：短时间内不易察觉，培养基尚澄清。
久之可用肉眼观察到培养基中有菌丝或菌落出现。
用倒置显微镜观察可见丝状或树枝状菌丝。
支原体污染：周期长，用常规方法不易检测，但影响细胞的生长与活性。
如果出现细胞长时间不明原因的生长不良和活性改变，则需进行支原体检测。
2. 细胞支原体污染的PCR检测DNA提取：（1）需要检测支原体污染的细胞系在检测前两周内用不含抗生素的培养基培养，以保证支原体在培养基上清中的效价在PCR测定范围之内。
（2）收集1 mL培养上清液，含活的或死的细胞，13000 g 离心5 min，沉淀用1 mL PBS 重悬浮，涡旋混匀。
（3）再次离心洗涤细胞，用1 mL PBS重悬浮，涡旋混匀。
重离心后，沉淀用100 uL PBS 重悬，涡旋混匀，然后加热至90℃， 15 min。
（4）细胞分解后，用Qiagen 公司的DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit提取DNA，-21℃贮存备用。
PCR反应：（1）根据支原体检测试剂盒说明进行PCR。
（2）PCR产物的EB检测。
（四）病毒在细胞中的感染增殖与重组病毒异源蛋白的细胞表达1. 病毒在细胞中的感染增殖与TCID50的测定（1）取对数生长期细胞，血球计数板计数，将细胞密度调整到2~3×105个/ml，接种到96孔微量培养板中，每孔加入细胞悬液100µl。
（2）在24孔微量培养板中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-2到10-10。
（3）将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔细胞，每孔接种100µl。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排（100µl生长液+100µl细胞悬液）。
（4）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
（5）按Reed-Muench法计算TCID50：2. 重组病毒异源蛋白的细胞表达（1）将Sf细胞进行传代培养，取对数生长期细胞进行病毒感染。
（2）将含有GFP基因的AcNPV重组病毒毒液感染Sf细胞，28℃培养。
（3）每隔24hr 在倒置荧光显微镜下观察。
若细胞出现绿色荧光则GFP基因在细胞中得到了表达。