南农-植物制片报告

石蜡制片法观察水生和旱生水花生茎
1、材料
水生水花生、旱生水花生、石蜡、刀片、白纸板、切片机、烘箱、酒精、二甲苯等实验器材，均由生科院c304实验室提供。

2、方法：
2.1 取材与固定
分别取水生和旱生的水花生，用刀片切成长约为1-1.5cm小段，每一种取约5小段，注意材料不宜过大。

材料取下后立即投入固定液中，固定材料的瓶上必须贴标签，标明取材日期，材料名称，小组名称。

固定可保持细胞原有的结构，并使组织硬化，便于切片和染色。

本实验采用F.A.A固定液固定材料，F.A.A固定液是植物制片中一种良好的固定液和保存液，材料平常固定2-24小时，但在此液中长期保存也无妨，加入5mL甘油效果更好。

F.A.A固定液配方：福尔马林（38%）5mL 冰醋酸5mL 酒精(70%)90 mL
但需注意：此固定液中含有酒精，易使原生质发生收缩现象，所以细胞学制片和固定单细胞生物、丝状藻类以及菌类，一般采用其它的专用固定剂。

如果是幼嫩的叶片则使用50%的酒精进行配制。

2.2脱水与透明
脱水是用脱水剂渗入植物细胞、组织中，使得细胞组织中原来的水分脱除干净，以便后继药物能更替进入其内。

通过脱水，使材料适当硬化，以利于切片。

本实验采用浓度逐级升高的酒精作为脱水剂，各级酒精脱水时间一般为2h，纯酒精要置换两次，但总的放置时间不能太长，以免材料变脆，步骤如下：
30% 50% 70% 85% 95% 100% 100% 材料经脱水后，必须用透明剂取代植物组织中的酒精，以便石蜡渗入其中。

本实验采用二甲苯和酒精为透明剂，逐级升高二甲苯的浓度，每级透明时间一般为2h，二甲苯的穿透力较强，不宜在其中放置过久，步骤如下：
1/2酒精+1/2二甲苯1/4 酒精+3/4二甲苯纯二甲苯纯二甲苯2.3浸蜡与包埋
浸蜡过程是用石蜡进一步取代植物细胞组织中的二甲苯，使石蜡充分渗入植物组织中的各个部分。

待石蜡凝固后，再切片，材料不致压碎破裂。

本实验采用熔点为52—54℃的石蜡，在投入之前先用刀片将蜡快修成碎末状，利用其融化，步骤如下：
在上述材料瓶中放入与二甲苯等体积的石蜡后，将材料放于40℃温箱中过夜。

第二天将温度升至50℃，打开瓶盖倾倒掉一半液体，再加入同量的碎末状石蜡；2h后将温度升至60℃，同时若蜡全融化，则再加如一些蜡；2-3h后换为已融化的纯蜡；2-3h后再换一次纯蜡，再经2-3h后即可包埋。

包埋就是用纯石蜡将整个材料埋藏凝固起来的过程。

包埋时，先用质地坚韧光滑不易透水的厚纸张折成小盒，小盒两端要标明材料和小组名称。

迅速将材料连同石蜡倒入纸盒中，用加热的解剖针，将材料迅速排好位置（直立，且材料与材料之间有一定的距离），若蜡中有气泡产生，可用烧热的解剖针把气泡烫去。

材料安置好后，向蜡面微微吹冷气，使蜡的表面凝结一层，两手执纸盒半浸入水中，待盒中的蜡凝成不透明状时，可平稳的将纸盒全部压入水中充分冷却。

半小时后可将包埋好的石蜡快材料取出晾干备用。

2.4切片、贴片和干片
切片使用螺旋式切片机进行。

先将蜡快修成上小下大的小块，粘于载蜡器上，将载蜡器
安装与切片机上，调整距离和角度，进行切片。

本实验切片的厚度为8μm ，用小刀将长条蜡带按20-30cm 逐段剪取，放于贴片处。

在干净的载玻片上，滴一滴粘贴剂（本实验使用的是蛋清和甘油1：1混匀，再加入微量的草酰乙酸经过滤而成），用干净的手将其均匀涂于载玻片上，再滴加足量的蒸馏水，将事先分好的蜡带小段移到载玻片上，使蜡带的光面朝下。

之后，将载玻片放在37℃温台上，待蜡受热完全展平后，用吸水纸将多余的水分吸去，放如36-40℃的温箱中继续烘烤1-2天。

2.5 脱蜡和染色
本实验采用番红-固绿整染法。

染色的结果是木质化的细胞壁和细胞核被染成红色，薄而具有纤维素的细胞壁及细胞质被染成绿色。

染色步骤如下：
将上述所制的片子淹没于番红中，过2天后将片子取出，用蒸馏时冲洗干净，放于温箱中烘3天。

再按如下步骤操作：
纯二甲苯（20min
） 纯二甲苯（1min ） 1/2酒精 + 1/2 二甲苯（1min ） 纯酒精（1min ） 纯酒精（20s ） 固绿（3min ） 纯酒精（1min ） 纯酒精（1min ） 镜检 1/2酒精 + 1/2 二甲苯（2min ） 纯二甲苯（3 min ） 纯二甲苯（3-5min ） 2.5封片、贴标签、干固与保存
将载玻片从二甲苯中取出，用干净的纱布擦去切片材料四周多余的二甲苯，然后上一小滴中性树胶，树胶用量要适当，要正好充满盖玻片下面。

将制好的玻片贴上标签，表明材料、日期和小组名，放于50℃的温箱中烘数天后，将玻片置于切片盒中避光保存，为显微镜下观察备用。

3、结果
在显微镜下观察水生花生和旱生花生茎的结构和测定相关值，具体见表1和图1-6。

注：表中数据均为校正后的数据。

（1）由图1和图2可知，水花生茎中中空，形成髓腔，由于髓腔作可作为通气组织。

水生环境下的水花生茎直径和髓腔直径及髓腔占茎的比例均大于旱生环境，能够较好的抵抗水生环境的机械压力和帮助通气，利于水花生水生环境的生存。

（2）维管束是植物体输导水分，无机盐及有机物质的一种输导系统——维管系统，并兼有支持植物体的作用。

水生环境中的水花生维管束的周长、面积及个数均比旱生水花生的大和多（见表1），导管个数几乎是旱生环境下的两倍(见表1、图5和图6)，发达的传输组织利于水生环境下处于直立状态和更好的传输水分和其它营养物质。

（3）水生环境下的皮层薄壁细胞平均面积较干旱环境下的大，且细胞间隙也较旱生环境下的大（比
较图3和图4），能够形成较大的气腔或贯连的气道，有利于气体交换，很好的适应水生环境。

（4）旱生环境下皮层到髓腔的层次较水生环境下多，这样可以储存大量的营养供植物利用，以抵抗干旱环境。

（5）旱生水花生的厚角组织较水生水花生的厚角组织多，也是对环境的一种适应表现。

厚角组织在植物体内起着支持的作用，同时能够防止茎内水分过度散失和病虫侵入，同时也可防止一些农药的进入。

而不影响透光和通气，使茎内的绿色组织正常地进行光合作用，这样有利于植物适应干旱环境。

（6）由上述分析可知：水花生在旱生条件下有发达的机械组织和薄壁组织；而在水生条件下有较发达的通气组织和发达的机械组织以增强植物的韧性。

所以无论在旱生还是水生条件下，水花生都有很强的适应性和分布很广的特点。

植物制片实验课体会
一：材料的体会
实验之前，我只知道水花生现在是一种危害较为严重的入侵植物，实验后我知道，光从水花生茎的结构特征来看，水花生无论在水生、旱生均有与其相适应的结构特征，它有很强的环境适应性，且结构可据生长环境发生变化，所以它有很广泛的分布就不足为奇的。

也正由于水花生水花生和旱生水花生茎结构的不同，能够清楚的了解到水生环境与旱生环境下植物植物是如何适应环境的。

且水花生茎的大小、软硬均很适合石蜡切片，这有助于我们石蜡切片的成功。

二：石蜡切片的体会
石蜡切片的整个过程，前期工作其实是使材料硬化，为切片准备，染色是为了利于看清结构。

实验结束后，才体会到石蜡切片不是一件容易的事情，需注意其中的每一个细节。

取材时，不能去太老的材料，不利于以后的切片，分小段时，尽量垂直分段；
脱水时，需将瓶里的液体到干净了；
透明时，蜡最好不要与材料接触，这就要我们在实验室操作时，需小心，且最后用到的二甲苯够则已，否则造成后面石蜡用量的增加；
浸蜡时尽量使石蜡和材料充分接触，越到后面越要注意使二甲苯挥发干净；
包埋，我认为是比较为关键的步骤，材料一定要垂直立于蜡中，我组实验可能就是因为材料此时倾斜，在修正蜡块时又只注意了一端，造成切片时，将材料切斜，而导致组织的损伤；
染色，是最为关键的部分，我组用番红染色时，先将片子放入盒中，而后加番红，结果片子飘起，经过处理后仍发现有片子重叠在一起，这样易损坏片子上的材料。

固绿染色时，由于片子在番红中浸泡较长的时间，此时材料与片子粘贴的已不是很牢固了，操作时应避免片子划伤。

但由于染色缸的设计和操作时的不小心，再次造成两个片子粘在一起的现象，以及用镊子夹取材料，最后镜检时已发现材损伤严重。

针对此种现象，我认为可以单片操作，必要时用手转移片子。

用番红染色时，可先到番红，不宜太多，刚能淹没片子即可。

封片，实际上是制片的最后一步，但也是相当重要的一步。

由于树胶粘性很好且干的快，再取胶时，要注意胶与片子的距离，小心胶的“泛滥”。

胶的量要控制好，太多不易干，太少若处理不当易有气泡。

取胶时，不应再用转移胶的玻璃棒在片子上调节胶的位置，易损坏材料，还易造成胶干而有气泡，所以封片需要敏捷和精准的判断。

对课程的感想：
在整个植物制片课过程中时间的安排很重要，这就需要小组与小组之间，小组成员之间进行协调，提高了我们的团结协作能力。

了解了石蜡制片的整个过程和注意事项，为日后相关的工作打下的坚实的基础。

提高了我们对于水花生的认识，要减少水花生，以预防为主。

学会了使用电脑软件对显微镜拍摄的图片进行处理。

注：实验结果可能缺乏科学性，我想可能是我选择测定的对象有关，测定时我选择生长较为好的结构或细胞进行测定的。

上述的观点，可能有很多的错误，还望王老师指点。