利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育

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16S和23S rDNA基因序列分析分类鉴定中国衣原体流行株

分子生物学的发展，衣原体分类又引入了分子遗传
学方法。
材料和方法
１材料
１Ｓ和２ＳｒＮ６３Ａ基因序列分析早已在细菌的Ｒ分类鉴定中得到应用。１９９９年国际分类委员会批准了ＥｅｅＤｖｒｔＫＥ等提出的以１Ｓ和２ＳｒＮｔ６３ＲＡ基因序列为基础的衣原体新分类体系… 。新分类中衣原体目共有４个科，中衣原体科分为衣原体属和其嗜衣原体属。衣原体属有３个种：眼衣原体沙
衣原体为严格真核细胞内寄生菌，可在动物和ｐｉａｉ、ｓｔ）流产嗜衣原体（ｈｍｄｐｉｂｒｓ、ｔｃＣｌｙｏｈｌａｏｕ）ａａｔ人中引起多种疾病。２Ｏ世纪出版的伯杰氏细菌学家畜嗜衣原体（ｈａｙｏｈｌｐｃｒｍ、Ｃｌｄｐｉｅｕ）肺炎嗜衣ｍａｏ
ＳＮｉｕ，ＥＪｎＺＯＧＬ－ａＨ，ＨＵ舶，ｔ１ＳａｅａｏａｏａｈｇｎａｄＢｏｅｕｉ，ｎｔｕｅＭｉｏｉｏｙａｄｈｕｅａ．（ｔｔＫｙＬｂｒｔｒｏｔｏｅｎｉｃｒｙＩｓｔｅｙｆＰｓｔｉｔｏｃｂｌｎｆｒｏｇ
ＥｉｍｏｏｙＡａｅｙｏＭｉｔｒＭｅｉｌｃｎｅ。ｅｎ００１Ｃｉ）ｐｄｉｇ．ｃｄｍｅｌｆｌａｙｄａｉｃＢｌｇ１０７．ｈｎｉｃＳｅｓｔｉａ
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环境16S rDNA和16S rcDNA序列分析湖光岩玛珥湖的浮游细菌组成

环境16S rDNA和16S rcDNA序列分析湖光岩玛珥湖的浮游细菌组成秦青英;曾永辉;郭倩茹;简纪常;鲁义善;吴灶和【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2013(33)3【摘要】Huguangyan Maar Lake belongs to a unique type of volcanic lake. Little is known about the microbial diversity in Maar Lake. So it is important to study the bacterial diversity in the water body for protecting and developing Maar Lake microbial resources. Total DNA and RNA were extracted from planktonic microbial communities in the Huguangyan Maar Lake, and 16S rDNA and 16S rcDNA clone libraries were constructed, and a number of clones were sequenced with the aim to analyze the genetic diversity of total bacterioplankton and active planktonic bacteria. Four clone libraries were constructed from the community DNA and cDNA of the 1 m and 10 m layers of the Huguangyan Maar Lake with 413 sequences reported, which were further classified into 15 phyla, 32 orders, and 52 families. Within the 16S rDNA library and 16S rcDNA library of the 1m layer, Verrucomicrobia occupied the largest proportion (36.8% and 32.1%, respectively), followed by Alphaproteobacteria (15.1% and 16%, respectively) and Betaproteobacteria (17.9% and 16%,respectively). Alphaproteobacteria represented the most abundant taxa within the two libraries of the 10 m layer with the proportions of 63.5%(rDNA) and43.8%(rcDNA), respectively, followed by Verrucomicrobia (11.5% and14.3%). Other bacterial groups include Acidobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, candidate phylum OD1, Planctomycetes, Spirochetes and Deltaproteobacteria, with a proportion of 0.8~3.8%documented. At the family level, SAR11 was the most abundant group in the bacterioplanktonof the Huguangyan Maar Lake, accounting for 26.9%in term of the number of clones and reaching a maximum of 51.5%at the 10 m layer. Sequence similarity analysis shows that most of the sequence (89.8%) may originate from novel species, of which 19.6%may come from novel genera and 69% may be derived from novel families. The community structure of bacterioplankton in the Huguangyan Maar Lake is very unique in terms of both diversity and abundance of bacterial groups. A large number of 16S rDNA and rcDNA clones do not have corresponding pure cultures, suggesting that the Huguangyan Maar Lake is inhabited by many novel bacterial species and that more attentions should be paid to the protection of the microbial resources in worldwide Maar lakes.% 通过提取环境总16S rDNA和总16S rRNA分别构建DNA克隆文库和反转录cDNA文库，并进行克隆测序和序列分析，探讨湖光岩玛珥湖浮游细菌和浮游活性细菌的遗传多样性。

关节液中细菌16srRNA与23s rRNA诊断膝关节置换术后感染的价值

ＺＨＥＮＧＺｈｏｎｇ，ＣＡＩＰｅｎｇｄｅ，ＧＵＥｎｙｉ，ＬＪＣｈａｏｘｉｏｎｇ，ＬＩＮＸｉａｎｇｑｕａｎ，ＣＨＥＮＧｕｏｌｉｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，
ｒＲＮＡａｎｄ２３ＳｒＲＮＡｉｎｊｏｉｎｔｆｌｕｉｄｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲａｓａｍａｒｋｅｒｔｏｄｉａｇｎｏｓｅＰＪＩ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ
异性９３．９，阳性预测值８８．２，阴性预测值为８８．６，准确性为８８．５；而采用２３ｓｒＲＮＡ扩增方法诊断的敏感性、特
异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性分别为６８．４％、７８．８、６５．０％、８１．２和７５．０％。两种基因诊断的各指标比较差异均无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。结论通过检测关节液中细菌１６ｓｒＲＮＡ或２３ｓｒＲＮＡ诊断人工膝关节置换术后感染，具
感染的价值
福州市第二医院骨科（福州３５０００７）
【摘要】方法的差异。方法
郑
忠
蔡碰德顾恩毅

6种区分乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的分子生物学方法比较

的 Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris ATCC19257 作为试验参考菌株。 1. 1. 2 试验主要试剂和仪器：伯乐公司变性梯度凝胶电泳仪（ Dcode system），TGL-16B 型台式高速离心机，ND-1000 型微量紫外分光光度计，ML-30L 型全自动高压蒸汽灭菌器，HHSI-NI 恒温水浴槽， CDS8000 型 UPV 凝胶成像分析系统，DHP-9272 型电热恒温培养箱，HZS-H 水浴振荡器，PL303 /01 电子天平，TGL-16G-A 型高速冷冻离心机，DG82 型干燥箱，PTC-200 型梯度基因扩增仪，电泳仪，本试验所用引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成，具体引物序列见表 1。
Sequence （5′→3′ ） CTACGGCTACCTTGTTACGA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GAAGTCGTAACAAGG CAAGGCATCCACCGT TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGG CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG GTGGTGGTGGTGGTG GAGGGTGGCGGTTCT
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 50（12）：1670 － 1676； 4 December 2010 ISSN 0001 － 6209； CN 11 － 1995 / Q http： / / journals. im. ac. cn / actamicrocn

16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用

第39卷　第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218;　[修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。

16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王　斌2(1　青岛市市立医院检验科,山东青岛　266011;　2　青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。

通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。

本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。

1　16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。

其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。

一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。

rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。

PCR-RFLP分析16s-23srDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

ａａｏｅｇｌｅｅｔｏｈｒｓｓＡＥａｄｈｒｓｌｓｉｅｔｄｙｈｅｔｉｔｏｎｙｅｓｏｅｇｒｓｅｌｃｒｐｏｅｉ（Ｇ）ｎｔｅｅｕｔｄｇｓｅｂｔｅｒｓｒｃｉｎｅｚｍｓｈｗｄ
枝杆菌扩增片段集中在４５ｂ，单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定３．％的受试菌种，酶０～５Ｐ７７３３
切结果显示：分枝杆菌的酶切图谱彼此不同结论
是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法。
１～２ＤＡ间区序列ＤＡＣｓｓＮ６３ｒＮＰＲ扩增和ＲＬ分析ＦＰ
ｔｉｎｈｗｅｔｔ１ｒｂｎｄｗｅａｗａａｐ１ｆｉｉｔｍｏｃｒｉｓｒｎｔａｔｈｅｏｓｏｄｈａｏ２ａｓｒｅｌｙｓｍｉｅｄｎｈｅｙｃｂａｔｅａｌｔａｉｓ，ｈｔａｍｐｌｆｅｆａｇｎｏｓｌｗｒｏｅｍｃｏａｅａａｓｎｅｅｗｅｎ４ａｄ８ｂｐｒｐｉｇｏｒｉｉｄｒｍｅｔｆｏｇｗｒｙｂｃｔｒｉｗｏｂｔｅ３０ｎ４０，ａｄｒｗｅｍｙｏｃｅａ４０ｎ５７ｂ３３ｓｒｎｓｏｕｌｂｉｅｉｉｄｙｈａｐｌｆｅｐｏｕｃｓｃｂａｔｒｉ７ａｄ５ｐ．３．％ｔａｉｃｄｅｄｎｔｆｅｂｔｅｍｉｉｄｒｄｔｏｆ
ＭｓｐＩ，ｂｗｈｉｈｈｅｙｃｔｄｉｅｒｎｃｅａｍｇｈｅｍｆｆｅｓｏｎｔａｐｌｉｅｆａｇｎｔａｎｄｍｏｔｈｒｅｓｒｉｆｉｄｒｍｅｓａｎｇｅｔｃｔｉｎｏ

用16S rDNA方法鉴定细菌种属

一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。

二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。

16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。

在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。

16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理：PCR 技术的基本原理类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠【摘要】目的比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用.方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16S rRNA、16S-23S rRNA基因进行PCR扩增.扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心( NCBI)上进行比对分析,确定菌种.结果在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16S rRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属；16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平.结论16S-23S rRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)003【总页数】5页(P181-185)【关键词】16SrRNA;16S-23SrRNA【作者】金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠【作者单位】上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126【正文语种】中文以菌血症和败血症为主的血流感染具有低发生率、高危险性的特点[1]。

据报道，美国血流感染的总体病死率可高达14%～63%，但在明确病原菌后采用针对性治疗，其死亡率可降至5%～17%[2～4]。

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ｉｔｗｏｇｏｐｔｈｉｌｒｔｖｌｆ２．Ｇｏｐｗａｏｏｅｆｌｗｇｏｉｇｓａｎｎｏｌｅｆｒｅｉｉｅｔｎｏｔｕｓａｔｅｓｍｉｉｌｅ％ｒａｙｅｏ５ｒｕ１ｓｃｍｐｓｄｏｏ — ｗｎｔｉｓａｄｃｕｄｂｔｒｄｖｄｄｉｏｓｒｒｕｈｎｔｏｂａｃｅ。ＩＡａｄｔｈｉｌｒｙｌｖｌｆ９．Ｇｒｕ１ｗａｏｏｅｆｆｓ－ｒｗｎｔａｎ，ｗｈｃｌｏｃｕｄｗｒｎｈｓｎＩＢａｅｓｍｉｉｅｅ％ｔａｔｏ７ｏｐＩｓｃｍｐｓｄｏｔｇｏｉｇｓｒｉｓａｉｈａｓｏｌ
ａｄ１ＳｒｎＲＮＡｎｅｕｎｉｇ６ＧｅｅＳｑｅｃｎ
ＰＮＦｎ，Ｎｉｇ，Ｈｈｎｊ，ＥＳａｊｎＡｅｇＷＡＧＰｎ一ＵＺｅｇａＨｈｏａｇ＆ＦＮｉｍｉｉｉＥＧＸｎｅ
列相似性为９．６９８％．ＣＹ３２与Ｂａｙｈｏｉｍｅａｉ的参比菌株ＵＤ８Ｙ３０ｒｄｒｉｂｌｎｉｚｕｋＳＡ６有最近的亲缘关系，序列相似性近似于
１００％．图４表１参１３关键词根瘤菌；６一２ＳｒＮＧＣ１Ｓ３ＤＡＩＳＰＲ—ＲＬ；１ＳｒＮＦＰ６ＲＡ基因；系统发育；饭豆
维普资讯
应用与环境生物学报
２０，３１：８～８０７１（）７２
ＣｈｎＪＡｐＥｎｉｏＢｉｌ＝ＩＮ１０６８ＸｉｐｌｖｒｎｏＳＳ０６－７
利用１Ｓ一３ＤＡＲＬ２ｒＮＦＰ及１ＳｒＮ６ＳＲＡ基因序列６分析方法对湖北省饭豆（ｉｎｍｅａａＬ）Ｖａｕｂｌｔ．ｇｌ
果可知，供试的４个代表菌株分别位于不同的系统发育分支中．Ｃ４４ＹＲ２３与Ｓｎｒｉｂｕｒｉ的模式菌株ＵＤ２５ｉｏｈｏｉｍｆｅｉｚｄＳＡ０
的序列相似性达到了９．７９８％．ＨＣ１０Ｙ１１与Ｒｉｂｍｌｕｉｏａｕ中的三叶草生物型（ｙｒｏｉ和豌豆生物型ｈｚｉｅｍｎｓｒｍｏｕｇｂ．ｔｌ）ｉｉｆ（ｙ￣ａ）ｂ．ｖｅｅ这两个生物型的参比菌株亲缘关系最近，序列相似性为１００％．ＨＹ２２与Ｒａｇｅ亲缘关系最近，Ｃ５０．ｇｌａｅ序
ＣＣＱ３．１．３：Ｑ５Ｌ９９１４０７
ＰｈｌｇｎｃＳｕｆＲｈｉｏｉｔａｎｓＩｏａｅｆｏｃａｙｏｅｉｔｄｙｏｚｂａＳｒｉｓｌｔｄｒｍＲｉｅＢｅｎ
（％ｎｍｂｌｔ）ｉｂｉｙ１Ｓ一３ＤＦＰＶａｕｅｌａＬ．ｎＨｕｅｂ６２ＳｒＮＡＲＬａ
Ｔｅｒｓｌｏ６ｈｅｕｔｆ１Ｓ一２ＳｒＡＧＳＰＲ —ＲＦＰｒｖａｅｈｔａｌｔｅｓａｎｓｌｔｄｆｍｉｅｂａｏｕｅｏｌｅｄｖｄｄ３ＤＮＩＣＬｅｅｌｄｔａｌｈｔｉｓｉｏａｅｒｒｏｒｅｎｎｄｌｓｃｕｄｂｉｉｅｃ
ｉＨｂｉｅｅｓｄｅｓｇ１Ｓ一２ＳｒＮｔｇｎｃｓａｅＩＳＣｎｕｅｗｒｔｉｄｕｉ６ｕｎ３ＤＡｉｅｅｉｐｃｒ（Ｇ）ＰＲ—ＲＬｎａｔｌ６ＲＡｇｎｅｕｎｉｇｎｒＦＰａｄｐｒａ１ＳｒＮｅｅｓｑｅｃｎ．ｉ
根瘤菌系统发育的研究冰
潘峰王平
摘要
胡正嘉何绍江冯新梅
武汉４０７）３００
（中农业大学农业微生物国家重点实验室华
采用１Ｓ一３Ｎ６２ＳｒＡ间隔区段（Ｇ）ＰＲ— ＦＰ与１ＳｒＮＤＩＳＣＲＬ６ＲＡ基因部分序列分析的方法对饭豆根瘤菌进行
了遗传多样性及系统发育分析．１Ｓ３ＮＳＰＲ—ＲＬ由６一２ＳｒＡＩＣＤＧＦＰ分析可知，有菌株在５％的相似性水平上聚在一所２
起，形成了慢生型菌群与快生型菌群这两大菌群．Ｉ中，７％相似性的水平上分为Ｉ群在９Ａ与ＩＢ两个分支． Ⅱ中，群在６％相似性的水平上分为 ⅡＡ与ＩＢ两个分支，２Ｉ分支 ⅡＡ在７％的相似性水平上进一步分为 ⅡＡ、ＩＡ２１Ｉ２和 ⅡＡ３三簇；分支ＩＢ中的饭豆根瘤菌与标准菌株ＵＤ２５聚在一起，ＩＳＡ０表现的差异并不大．１ＳｒＮ由６ＲＡ基因部分序列分析结
（ａａｏａｏｇｉｌｒｌｒｂｌｙｕｚｏｇＡｒｕｕａｎｖｒｔＫｙＬｂｒｔｙｏｒｕｔａｏｗｏ，Ｈａｈｎｇｉｌｒｌｉｓｙ，Ｗｕａ３００，ｈｎ）ｒｆＡｃｕＭｗｇｃｔＵｅｉｈｎ４０７Ｃｉａ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ＡｂｔａｔＴｅｇｎｔｉｒｉｎｈｌｅｙｏｅｒｉｂａｉｌｅｏｏｕｅｆｃｅｎ（ｉａｕｂｌｔ．ｒｎｓｃｈｅｅｉｄｖｓｙａｄｐｙｇｎｆｈｈｏｉｓａｄｆｍｎｄｌｓｅａＶｎｍｅａａＬ）ｇｏｒｃｅｔｏｔｚｏｔｒｏｒｂｉｇｌｗ