临床执业医师《微生物学》细菌感染的诊断及各知识点辅导

2012年临床医师《微生物学》辅导细菌感染的诊断一、检测细菌或其抗原(一)直接涂片显微镜检查自病人标本直接涂片作染色镜检是简便而快速的方法之一。

自一定部位采集标本作直接检查需考虑细菌的形态特征与可能存在的细菌数量。

脑膜炎患者的脑脊液和瘀斑刺破涂片，常可显示在细胞内的革兰氏阴性肾形双球菌，有诊断价值。

白喉患者咽部假膜涂片中可见典型的杆菌有时可有异染颗粒，也有参考诊断价值。

结核患者痰直接或浓集后，涂片抗酸染色检出结核杆菌有诊断价值。

在少数情况下，也有利用免疫荧光或酶标记抗体染色镜检方法进行快速诊断，如粪例中的霍乱弧菌、痢疾杆菌等，可用这种技术检出。

(二)培养大多数病菌的形态与染色并无特征，因此需用培养方法来分离与鉴定细菌。

虽然这一方法需要的时间较长，但比较可靠。

此外，只有通过这一方法才能获得细菌的纯培养，可用于做药敏试验或毒力试验。

应根据不同细菌需要的营养、生长条件(如厌氧或CO2)、菌落生长特征来初步识别细菌。

如溶血性链球菌需在血琼脂平板上生长，菌落小而透明，菌落周围有完全溶血圈，可资鉴别。

多数细菌欲确定为何种病原菌尚需进一步获得纯培养及接种各种特殊培养基进行生化反应试验或确定其抗原性与致病力等。

(三)生化反应细菌的合成与分解代谢过程中，能通过酶利用一些物质或分解一些物质。

不同的细菌具有不同的酶，因此各种细菌能够利用与分解的物质也各不相同。

利用各种细菌的不同生化反应帮助鉴别细菌在某些细菌如肠道杆菌中是很重要的步骤。

例如肠道杆菌均为革兰氏阴性杆菌。

菌落形态亦相似，但对于糖的发酵结果不同，因此可利用不同种糖作为培养基质进行生化反应予以区别。

(四)抗原检测与分析有些细菌即使用生化反应变难区别，但其细菌抗原成份(包括菌体抗原、鞭毛抗原)却不同。

利用已知的特异抗体测定有无相应的细菌抗原可以确定菌种或菌型。

常用的方法为玻片凝集反应，用已知的特异免疫血清与待鉴定的细菌在玻片上做凝集反应，如出现凝集菌团则为阳性，说明该菌有相应的特异抗原。

近年采用了各种检测抗原的敏感方法，如对流免疫电泳、放射免疫、酶免疫、气相色谱等方法，试图直接从患者标本中检测细菌抗原作快速诊断。

如果在细菌性脑膜炎中，利用对流免疫电泳在脑脊液中可分别检测肺炎球菌、脑膜炎球菌及流感杆菌，特异性高，敏感性亦高。

气相色谱方法系列利用细菌代谢产生的挥发性短链有机酸，进行气相色谱分析可鉴别细菌，这在厌氧菌中应用很广。

检测抗原的另一优点为在应用了抗生素治疗后，细菌生长被抑制，利用培养方法不能检出的细菌，因尚有抗原存在，在短期内仍可被检出，从而有助于明确病因。

个别情况下还可利用噬菌体对细菌抗原型别分析，用于流行病学追踪调查。

二、检测抗体人体受病菌感染后，经一定时间产生抗体，抗体的量随病菌感染过程而增多，表现为效价升高。

因此用已知的细菌或抗原检测患者体液(主要为血清)中有无相应抗体及抗体量的动态变化，可辐助诊断。

一般采用血清进行试验，故又称为血清学试验。

血清学试验适用于抗原性较强的病原菌及病程较长的传染病诊断。

正常人如已经受过某些病原菌隐性感染或近期进行过预防接种，血清中可能含有对该种病原菌的一定量的抗体，因此必须有抗体效价升高或随病程递增才有参考价值。

例如伤寒患者血清抗体的检查称为肥达氏试验(Widal test，即将患者血清不同稀释后，与伤寒、副伤寒菌抗原在试管中做凝集反应。

根据最高血清稀释度仍有明显凝集的血清抗体效价，结合患者具体情况作为诊断。

多数血清学试验的诊断需取患者双份血清，即一份在疾病的急性期，另一份在恢复期(一般为2～6周后)，当抗体效价升高4倍以上方有诊断价值。

因此血清学诊断主要为病后的回顾性诊断。

但目前有利用检测某些细菌某些细菌特lgM抗体的早期诊断方法。

此外，在检测测抗体时至少应有怀疑可能致病细菌的线索方可采用相应抗原，否则就无从选择做何种血清学试验。

有些患者因早期使用抗生素治疗，细菌在体内繁殖不多，患者可不产生抗体，因而并非每一患者均有抗体效价升高的表现。

然而当病原菌未能被检出时，有些患者仍可通过血清抗本效价的升高予以诊断，因此检测细菌是互相辅助的诊断方法。

三、检测细菌遗传物质通过检测病原体遗传物质来确认病原体也许是检查病原体为直接的方法了。

目前比较成熟的技术包括基因探针技术和PCR技术。

(一)基因探针技术用标记物标记细菌染色体或质粒DNA上的特异性片段制备成细菌探针，待检标本经过短时间培养后，经过点膜、裂解变性、预杂交和杂交后，利用探针上标记物发出的信号可以知道杂交结果并判断病原体的性质。

基因探针技术操作比较复杂，加之同位素污染等问题，目前尚不能普及应用。

近年来发展起来的地高辛标记的非同位素探针，从探针标记到杂交都很方便，只是价格昂贵，仍限于科研应用，尚不能普及。

(二)PCR技术这是八十年代末发展起来的一项极有应用价值的技术，设计病原体基因的特异引物，细菌标本(不经培养)经过简单裂解、变性后，就可在PCR仪上进行扩增反应，经过25～30个循环，通过琼脂糖电泳即可观察扩增结果，检出病原体。

这种技术的特点是简便、快速。

它尤其适于那些培养时间较长的病原菌的检查，如结核杆菌、支原体等。

PCR高度的敏感性使该技术在病原体诊断过程中极易出现假阳性，避免污染是提高PCR诊断准确性的关键环节。

菌群失调常见诱因在一定条件下，正常菌群中的细菌也能使人患病：①由于机体的防卫功能减弱，引起自身感染。

例如皮肤粘膜受伤(特别是大面积烧伤)、身体受凉、过度疲劳、长期消耗性疾病等，可导致正常菌群的自身感染;②由于正常菌群寄居部位的改变，发生了定位转移，也可引起疾病。

例如大肠杆菌进入腹腔或泌尿道，可引起腹膜炎、泌尿道感染。

因此，这些细菌称为条件致病菌。

在正常情况下，人体和正常菌群之间以及正常菌群中各细菌之间，保持一定的生态平衡。

如果生态平衡失调，以至机体某一部位的正常菌群中各细菌的比例关系发生数量和质量上的变化，称为菌群失调。

菌群失调的常见诱因主要是使用抗生素、同位素、激素、患有慢性消耗性疾病时肠道、呼吸道、泌尿生殖道的功能失常也是重要原因。

去除诱因后一般可使菌群复常，也有长期失调难于逆转的情况。

临床上常见的菌群失调症有：①耐药性葡萄球菌繁殖成优势菌而发生腹泻，偶尔发生致死性葡萄球菌脓毒血症;②变形杆菌和假单胞菌生长旺盛并侵入组织发生肾炎或膀胱炎;③白色念珠菌大量繁殖，引起肠道、肛门或阴道感染，也可发展成全身感染;④艰难梭菌在结肠内大量繁殖，并产生一种肠毒素及细菌毒素，导致假膜性肠炎。

消化球菌属是口腔、肠道、女性生殖道、皮肤等处的正常菌群。

革兰氏阳性球菌，直径0.5～1um，成单个、双个、四联或小堆。

无鞭毛、无芽胞、专性厌氧菌。

本菌为条件致病菌，常和其他菌混合感染，也可单独感染。

在菌血症、手指感染、乳腺脓肿、前列腺炎、肺部感染、中耳炎和各种化脓性感染时均可分离到消化球菌。

在一些口腔感染性疾病时，如牙髓感染时也可分离出消化球菌。

消化链球菌属菌体为革兰氏阳性，易变为革兰氏阴性菌，园形或卵园形，大小不等，直径0.3～1um，成双、短链状、无鞭毛、无芽胞。

专性厌氧。

口腔、上呼吸道、肠道、女性生殖道正常菌群。

本菌属中以厌氧消化链球菌(P.anaerobic)最常致病。

消化链球菌可引起与诺非氏芽胞杆菌相似的急性坏疽，脓恶臭，产气较少而水肿严重。

这种气性坏疽战伤多见，平时较少。

口腔、上呼吸道、肺胸膜感染中可出现，微小消化链球菌寄生于口腔牙缝，直径0.3～0.5um，对糖和蛋白均无反应，常由于拔牙进入血循环引起亚急性细菌性心内膜炎，也常在头颈部、口咽、上呼吸道感染中出现。

细菌分类方式及结构细菌可以按照不同的方式分类。

细菌具有不同的形状。

大部分细菌是如下三类：杆菌是棒状;球菌是球形(例如链球菌或葡萄球菌);螺旋菌是螺旋形。

另一类，弧菌，是逗号形。

细菌的结构十分简单，原核生物，没有膜结构的细胞器例如线粒体和叶绿体，但是有细胞壁。

根据细胞壁的组成成分，细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

“革兰氏”来源于丹麦细菌学家革兰(Hans Christian Gram)，他发明了革兰氏染色。

有些细菌细胞壁外有多糖形成的荚膜，形成了一层遮盖物或包膜。

荚膜可以帮助细菌在干旱季节处于休眠状态，并能储存食物和处理废物。

外毒素与内毒素的区别区别要点外毒素内毒素存在部位由活的细菌释放至细菌体外为细菌细胞壁结构成份，菌体崩解后释出细菌种类以革兰氏阳性菌多见革兰氏阴性菌多见化学组成蛋白质（分子量27，000～900，000）磷脂一多糖一蛋白质复合物（毒性主要为类脂A）稳定性不稳定，60℃以上能迅速破坏耐热，60℃耐受数小时毒性作用强，微量对实验动物有致死作用（以ug计量）。

各种外毒素有选择作用，引起特殊病变，不引起宿主发热反应。

抑制蛋白质合成，有细胞毒性、神经毒性、紊乱水盐代谢等稍弱，对实验动物致死作用的量比外毒素为大。

各种细菌内素的毒性作用大致相同。

引起发热、弥漫性血管内凝血、粒细胞减少血症、施瓦兹曼现象等抗原性强，可刺激机体产生高效价的抗毒素。

经甲醛处理，可脱毒成为类毒霉，仍有较强的抗原性，可用于人工自动免疫刺激机体对多糖成份产生抗体，不形成抗毒素，不能经甲醛处理成为类毒素细菌侵入的数量和适当的侵入部位病原微生物引起感染，除必须有一定毒力外，还必须有足够的数量和适当的侵入部位。

有些病原菌毒力极强，极少量的侵入即可引起机体发病，如鼠疫杆菌，有数个细菌侵入就可发生感染。

而对大多数病原菌而言，需要一定的数量，才能引起感染，少量侵入，易被机体防御机能所清除。

病原菌的侵入部位也与感染发生有密切关系，多数病原菌只有经过特定的门户侵入，并在特定部位定居繁殖，才能造成感染。

如痢疾杆菌必须经口侵入，定居于结肠内，才能引起疾病。

而破伤风杆菌，只有经伤口侵入，厌氧条件下，在局部组织生长繁殖，产生外毒素，引发疾病，若随食物吃下则不能引起感染。

病原菌的这种特性是它的寄生与机体免疫系统抗寄生相互作用，长期进化过程中相互适应的结果。

细菌染色体细菌作为原核型微生物，虽没有完整的核结构，但却有核区（或核质）。

在电镜下观察，核区有盘旋堆积的DNA纤维。

自大肠杆菌提取的DNA是一条完整的DNA链，分子量为2.4×109daltons，仅为人体胞DNA量的0.1%.细胞的DNA含量决定存在的基因数。

如按每个基因由平均为1000个碱基对估计，大肠杆菌的DNA约为4×106个碱基对，因此约有4000个基因，可编码几千种多肽。

细菌染色体DNA与其他生物相同，由互补的双链核苷酸组成。

细菌的染色体与生物细胞染色体不同，前者不含有组蛋白，基因是连续的，无内含子。

由于细菌核区DNA的功能与真核细胞染色体的功能相同，因此又称其为细菌染色体。