软骨Ⅱ型胶原的制备及其毒理学评价

各种原 因造成 的关节 软骨损伤是 临 床常见病 ． 日常生话 和刨伤 均可 导致 关 节软骨 损伤 ． 进而 引发骨关节炎 、 节功 关 能障碍 等“ 。 Ⅱ型胶 原 （ ＣⅡ） 关 节 是
软骨的 主要 成分 ， 软骨细胞 的细 胞外 是
一
结
果
、
ＣⅡ的检测
Ｊｃ Ⅱ电泳谱见图 ｌ 。
维普资讯
∞吐 平 ５月第 １ 眷 第 ５ ８
Ⅷ
．８ Ｎ １ ｏ．
・
技 术 与 方 法 ・
软骨 Ⅱ型胶 原 的制 备 及其 毒理 学评 价
叶眷婷 李斯 明 邹海燕 彭燕豪 叶惠 贞 粱佩红
表 １ ＣⅡ氨基酸成分 （ ｍ Ｙ ） ｍ ｏ Ｌ
基金项 目： 广州市重 点攻 美课 题 资助项
目（ ４ ９ 一Ｚ一３ —２ ２ ）
过敏性试验及溶血性试验等 的检测 ， 结构 。采用 ２０ｇＬ的 Ｎ Ｃ 溶液 去除脂 验 、 ０ ／ ａＩ 纯化 的 ＣⅡ无毒副作 用 ， 而且 质及血清成分 ， 条件 温和 ， 可确保艘 原 的 证 实提取 、 活性 ：在整个提取 ， 纯化过程 中， 多次采 体外软骨细胞 培养也证实其具 有 良好 的 是可 以安全使 用 的医用 生 用 Ｎ Ｃ 盐析 手段 来 去除 障解或 变 性 的 细胞相 容性 ， ａＩ
１ 刘景堂 ． 葛宝丰 ． 关节软骨缺损修复的研 究现状 ．中华骨 科 杂 志 １ ８ ８ ３２— ９ ．１ ：］ ９
腔原部分 ． 确保最后得到纯度高的样品。 物材料。
作者 单位 ： １ ２ 广州 市红 十字 尝 医 ５０ ０ ２ 皖、 壁南大学 医学 院第 四附 属医院 戗伤外 科 研究所（ 叶春婷 Ｅ ａ ： ｃｆ ６ ） ｍ ｉ ｙ ｈ ＠１ ｌｅ ｉ ３
维普资讯
２ 毒理学 试验 ：参照 文献 ［ ］ 行 细胞 的特征 ： ４进
的日 二聚体 ， 本样 品与 其 相符 ， ｓ ｍ 而 ｉ ｇ
讨 论 公司 的产 品除 了含 ｎ 和 口 外 ， 带 带 还有
急性毒性 试验 、 刺激性试验 、 过敏性试验 及溶 血性 试验。体外 细胞培 养选 用软骨 细胞进行 培养 ： 首先 从兔透 明 软骨 中分
中性 ， ０ ２ｒ ｆ ａ Ｉ ． ｏ ＬＴｉ— 经 ． ￣ ＬＮ Ｃ、 ５ｍ ｌ ｒ ｒ ＇ Ｏ ／ ｓ ＨＩ Ｃ 透析平衡 后 ， 常温下上 Ｉ Ａ ５ ） Ｆ ２阴离 Ｅ
Ｂ ｂ
图 １ Ⅱ型腔 原 Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ Ｏ Ａ Ｅ电 泳 图 谱 。 ａ Ｓ ｔ 公 司 产 品 ； ｂ 自钳 样 品 ｉｍ ｇ 注 ： 脯氨酸与脯氮酸之 比， 羟 自制 样 品 为 ０啪 ，ｉ呻 公 司产 品 为 Ｏ ７ ｓ ∞
子柱 ， 流出液即为 Ｃ Ⅱ。收集 ＣⅡ溶液 凋
２ ．ＣⅡ 紫 外 光 谱 最 大 吸 收 峰 在
从电泳图谱和和氨基 酸成 分分析 的
３ ． 珂 至酸性 ， 盐析 ， 酸溶 ． 对水透析脱盐 ， 冻 ２ ３８ｎ 处 。 冷 ３ ＣⅡ氨基酸成分分析见表 １ ． 。 干燥 ： 二、 Ｉ Ｃｌ的检 测
哩 生
璺 鲞墨 塑
』
・ ‰ 姗 ，
， ｏ １， ｏ５ Ｖｌ ８ Ｎ
２ ０１ １ ２ ０ ， ７：０—２ ２
参
考
文
献
１８ ９ ２． ３ — ６ ３ ４
３ 史炜 镔 ，柴 奉甫
骨基 质 蛋 白 基 因在 骨 折 ６ 李 玉 瑞 ， 编 ．细 胞 外 间质 的 生 物 化 学 及 主
结果 中可以看 到 ， 本法制 各 的样 品 与美
国 Ｓｙ ａ ｉｎ 公司的产 品相 比， ： 纯度更 高 ． 与
二， 毒理学试验
１ 理 化 性 能 检 测 ： Ｄ Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ Ａ Ｅ电
急性毒 性试验 、 刺激性试验 、 过敏性 参考文献 ［］ ６的标准 图谱和参 考值一致 。
Ⅱ是 由 ３条相 同的 ｎ 带链构 成的 ， 电 故 泳 ． 外最 大吸收光谱 检测 ． 紫 氨基酸成分 试验及溶血性试验 的结果均 为阴性 。体 Ｃ 外培养 的软 骨细 胞增 殖 良好 ， 现软骨 泳 图谱 呈现出 １ 呈 条含量高 的 ａ 带和少量 分析。
小分子 质量 的条 带 ， 明含 有一些 降解 说
ＣⅡ是 软骨基质 中含量最高 的主要 产物或 小分子杂质。在 氨基酸成分分析 车样品 的羟脯 氨酸和 脯氨酸 之 比为 为 离软骨 细胞 ， 然后 接种 在 以 ＣⅡ包 被 的 有机成 分 ， 软骨 组 织 的特 征性 蛋 白。 中， ７， ６ 的参考值 ， Ｓ ｍａ 而 ｉ ｇ 属 培养板 中， 浸人体 积分数 为 １％ 的胎 牛 它与糖胺 多糖形成 紧密 的结合 ， 不溶 ０９０ 符 台文 献 ［ 】 ０ 公司的产品只有 ０ ７ｏ 与参 考值相差较 ．７ ， 难 血清 Ｆ２培养 液 ， １ 置于 ”℃ 、 体积分数为 性胶原 ， 以用化 学方 法提取 。笔 者 ３ ． 在酸 性条件下 ， 胃蛋 白酶处 理 ， ＣⅡ 远。本样 品的紫外 最大吸 收峰在 ２３ ８ 用 将 ５ ％的 ｃ 孵箱 中培养 。 ｎ ｍ处 ， 符合 ＣⅡ的特征 。 两端 的非螺 旋结 构的端肽 部分 切除 ， 使 笔者 通过 急性 毒性试 验 、 刺激 性 试 之变为可溶而 又不影响胶原分子 的螺旋
间质 ， 可影 响细胞 的形 态 ， 控制细胞 的迁 移、 增殖 ． 导细 胞 的分 化 。因此 ， 诱 】 笔 者研制了 ＣⅡ， 其作 为 安全 的 医用 生 使 物材料 ， 以后用 于软骨缺 损 修复 的研 为 究和产品开发奠定 基础。
材 料 与 方 法
一
、
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ＣⅡ的制备
从新鲜屠宰的猪关节 中切取透 明软 骨 ， 脂， 脱 捣碎 ． 后分别用 ４ｍ ｌ 然 ｏ Ｌ的盐 ／ 酸胍去 除蛋 白多糖 ， 用 胃蛋 白酶酶解 ， 再 氯化钠 （ ａＩ盐 析后用 醋 酸溶 解 ， 至 Ｎ Ｃ） 嗣