干细胞培养全攻略
干细胞提取和培养的实用技巧和建议
干细胞提取和培养的实用技巧和建议干细胞是一类具有自我更新和多分化潜能的特殊细胞，对于生命科学研究和医学应用具有重大意义。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的基础工作，在实验室中有着重要的地位。
本文将给出一些关于干细胞提取和培养的实用技巧和建议，希望能对正在进行相关研究的科研工作者有所帮助。
一、干细胞提取的技巧和建议1.选择合适的样本：干细胞的来源多种多样，可以从胚胎、成体组织以及体液等多个渠道获取。
在选择样本时，需要根据自己的研究方向和实验要求来确定合适的来源。
同时，注意样本的获取方式需要符合伦理规范，尽量避免伤害动物或人体。
2.有效的细胞分离方法：干细胞通常以混合细胞群的形式存在于样本中，为了提取纯度较高的干细胞，需要采用有效的细胞分离方法。
常见的方法包括流式细胞术、磁珠分离和显微操纵等，选择合适的方法可以提高细胞分离的效率和纯度。
3.培养条件的优化：提取到的干细胞需要在体外培养中继续生长和扩增，为此，需要针对不同类型的干细胞优化培养条件。
确保培养基的成分和浓度适宜，相应的生长因子和细胞因子能够为干细胞提供必要的生长和分化信号。
4.维持干细胞的干性特性：干细胞的一个特点是具有自我更新和多向分化的能力。
在培养过程中，需要采取一系列措施来维持干细胞的干性特性。
例如，添加适量的抑制剂，调整培养基中的成分，以及维持细胞接触的方式等。
二、干细胞培养的技巧和建议1.培养器具和环境的准备：在进行干细胞培养前，需要对培养器具和环境进行彻底的清洁和消毒。
确保培养皿、培养箱和其他实验室设备无菌，避免细菌和霉菌等污染对干细胞生长的影响。
2.细胞传代的控制：在干细胞的长期培养中，细胞传代是不可避免的。
然而，过多的细胞传代会导致细胞老化和凋亡，影响干细胞的生理状态和功能。
因此，需要控制细胞传代的次数，同时选择合适的传代方法，以保持干细胞的长期稳定生长。
3.培养基的配制和补充：培养基的成分和浓度对干细胞的生长和分化起着重要的作用。
干细胞流程及注意事项说明
干细胞流程及注意事项说明干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景。
在干细胞的研究和应用过程中，需要遵循一定的流程和注意事项，以确保研究的准确性和安全性。
一、干细胞流程1. 采集干细胞：干细胞可以从胚胎、成体组织和体外重编程等多种途径获得。
胚胎干细胞的获取需要通过胚胎移植、体外受精等方法，而成体组织干细胞则可以通过骨髓、脐带血等组织的提取获得。
体外重编程则是通过基因编辑技术将普通细胞转化为干细胞。
2. 培养干细胞：获得干细胞后，需要进行培养以维持其生长和增殖。
培养基的选择和配方对干细胞的生长和分化具有重要影响。
培养条件应提供适当的营养物质、生长因子和细胞外基质，同时控制培养温度、氧气浓度和pH值等因素。
3. 干细胞分化：干细胞具有多能性，可以向不同细胞类型分化。
通过控制培养条件和添加特定的诱导因子，可以使干细胞分化为神经细胞、心肌细胞、肝细胞等特定细胞类型。
分化过程中需要监测细胞表型和功能的变化，以确保分化的准确性和效率。
4. 细胞鉴定和纯化：在干细胞的分化过程中，需要进行细胞鉴定和纯化，以确保获得纯种的目标细胞。
常用的鉴定方法包括免疫细胞化学染色、流式细胞术和基因表达分析等。
通过这些方法可以确定细胞的表型和基因表达特征，并排除其他细胞类型的干扰。
5. 功能评估和应用研究：获得纯化的特定细胞后，可以进行功能评估和应用研究。
通过细胞功能评估可以了解其生物学特性和功能表现，如细胞增殖能力、分泌物产生、细胞迁移能力等。
在应用研究方面，干细胞可以用于组织工程、疾病模型建立、药物筛选等领域，具有很大的潜力。
二、干细胞研究和应用的注意事项1. 遵守伦理规范：干细胞的研究和应用需要遵守伦理规范，尊重生命和个体权益。
在胚胎干细胞的研究中，需要遵循胚胎保护和人类研究伦理的相关法律法规。
2. 安全控制：在干细胞的培养和分化过程中，需要注意细胞的无菌操作和安全控制。
保持培养器具和试剂的消毒和清洁，避免细菌、病毒等污染物的侵入。
干细胞流程及注意事项说明
干细胞流程及注意事项说明干细胞流程及注意事项说明引言：干细胞是一种具有自我更新和分化成各种细胞类型的特殊细胞。
它们在医学和生物科学研究中具有巨大的潜力。
干细胞疗法被视为未来医学的重要突破，可以用于治疗多种疾病和损伤。
然而，干细胞研究和应用过程中需要遵循一定的流程和注意事项，以确保安全和有效性。
本文将深入探讨干细胞的流程，并提供相关注意事项的说明。
一、干细胞获取流程1. 采集来源干细胞可以从多种来源获得，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。
每种来源有其特定的流程和技术要求。
2. 胚胎干细胞的获取胚胎干细胞主要来自胚胎发育的早期阶段。
在获得胚胎干细胞时，需要注意以下事项：- 获得捐赠的胚胎，并经过捐赠者的知情同意和伦理审查。
- 将胚胎培养到适当的发育阶段。
- 从发育早期的胚胎中分离出内胚层细胞，并将其培养为干细胞系。
3. 成体干细胞的获取成体干细胞存在于成人体内的各种组织和器官中。
获取成体干细胞时，需要注意以下事项：- 通过医疗手段或手术采集组织，如骨髓或脂肪组织。
- 分离组织中的干细胞，并培养其扩增为足够量。
4. 诱导多能干细胞的获取诱导多能干细胞是通过重新编程成体细胞而获得的多能干细胞。
获取诱导多能干细胞时，需要注意以下事项：- 获得捐赠者的细胞样本，如皮肤细胞。
- 将细胞样本重新编程，使其转变为诱导多能干细胞。
二、干细胞应用流程1. 干细胞培养和扩增在应用干细胞前，需要将其培养和扩增到足够数量。
这一过程涉及到培养基的选择、培养条件的优化和细胞生长的监测。
2. 干细胞分化干细胞可以分化为多种不同的细胞类型，如神经细胞、心肌细胞等。
控制干细胞的分化过程需要考虑以下因素：- 合适的生长因子和信号分子的添加。
- 适当的培养条件，如温度、养分和氧气浓度。
- 分化过程的监测和控制。
3. 干细胞移植当干细胞已经分化成特定的细胞类型后，可以将其移植到患者体内进行治疗。
移植过程需要注意以下事项：- 医学团队的专业知识和技术要求。
干细胞培养基的配制及培养方法指南
干细胞培养基的配制及培养方法指南干细胞（Stem Cells）是具有自我更新和多能分化能力的一类特殊细胞，具有广泛的潜在应用前景。
在干细胞研究中，正确的培养基配制及培养方法是确保细胞生长和分化的关键。
本文将为您介绍干细胞培养基的配制及培养方法指南，以帮助您顺利进行实验。
首先，让我们来了解一下干细胞培养基的组成。
一般来说，基本的干细胞培养基主要包括培养基基础（Basal Medium）和补充物（Supplement）。
培养基基础是为细胞提供必需的营养物质和生长因子，而补充物则可以根据实验需求来进行选择和添加。
一、干细胞培养基的配制1. 首先，准备好培养基基础。
常用的干细胞培养基基础有DMEM/F12、RPMI 1640、E8等。
您可以根据实验的需要选择适合的基础培养基。
2. 接下来，选择适当的补充物。
常用的补充物包括胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、基础纤维生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）、人血小板衍生生长因子（Platelet-Derived Growth Factor, PDGF）等。
具体选择和添加的补充物应根据干细胞类型和实验目的来确定。
3. 正确控制pH值。
将培养基基础和补充物按照比例混合后，使用pH计检测pH值，通常干细胞培养基的pH值应保持在7.2-7.4之间。
4. 最后，将配制好的培养基过滤以去除可能存在的微生物，然后储存在低温环境中，避免光照和冻结。
二、干细胞培养方法指南1. 准备培养皿。
选择含有黏附因子的培养皿，如明胶、凝胶体、胎牛血清等。
在使用之前，进行预处理，以去除可能存在的细菌和残留的化学物质。
2. 培养基更换和细胞分割。
干细胞培养过程中，定期更换培养基以提供新鲜的养分和生长因子。
另外，当细胞达到一定程度的密度时，需要将其分割为合适的尺寸，以保持细胞的良好生长。
3. 细胞培养环境的控制。
干细胞在培养过程中对环境的要求较高，需要在无菌和恒温的环境下进行培养。
干细胞的培养与扩增技巧
干细胞的培养与扩增技巧干细胞，作为一种具有自我更新及分化能力的特殊细胞，被广泛应用于生物医学研究和临床治疗。
为了获得足够数量的干细胞，培养和扩增技巧成为必不可少的步骤。
本文将介绍干细胞的培养和扩增技巧，帮助读者了解如何有效地进行干细胞培养。
首先，合理选择培养基是成功培养干细胞的关键。
常用的培养基包括表达钠离子通道的KSR培养基、mTeSR培养基、E8培养基等。
这些培养基中均含有必需的营养物质和生长因子，可以提供干细胞所需的环境。
对于不同类型的干细胞，选择适合其生长和分化的培养基是至关重要的。
其次，细胞传代的技巧是干细胞扩增的关键步骤。
传代是指将已达到一定密度的细胞转移至新的培养皿中，继续进行培养。
传代过程中，应注意以下几点：首先，防止细胞过度接合，应尽量减少细胞间的物理接触。
其次，选择合适的离心速度和时间，以确保细胞沉积在适当的位置。
最后，密切观察细胞形态的变化，如发现细胞生长异常或出现杂质，应及时采取措施。
此外，维持适宜的细胞密度也是干细胞扩增的重要方面。
过高或过低的细胞密度都可能影响到干细胞的增殖和分化能力。
一般而言，细胞密度不宜超过80%的培养皿表面积。
当细胞增殖达到一定程度时，应及时传代，以保证细胞在一个适宜的状态下进行生长。
除了基本的培养技巧外，还有一些其他的技术可用于干细胞的扩增。
例如，干细胞的分离技术可以通过采用不同的细胞表面标记物，将具有特定功能或特性的细胞选择性地分离出来。
此外，基因编辑技术的应用也使干细胞扩增变得更加高效和精准。
如果想要提高干细胞的扩增效率，还可以考虑使用辅助因子。
辅助因子是指可以促进干细胞增殖和保持干细胞状态的物质，如2i/LIF和bFGF等。
这些辅助因子可以显著提高干细胞的生长速度和倍增能力。
在进行干细胞培养和扩增时，还需要严格控制培养条件。
温度、湿度和氧气浓度等因素均会影响细胞的生长和分化。
因此，应确保培养箱内的环境稳定，并避免温度和湿度的剧烈波动。
另外，为了保持培养皿内良好的细胞状态，应避免震动和搅拌等可能造成机械损伤的情况。
干细胞培养操作步骤详解
干细胞培养操作步骤详解干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，具有重要的研究和应用价值。
为了能够在实验室中进行干细胞的培养与研究，科学家们经过不断的探索与总结，发展出了一套可行的干细胞培养操作步骤。
本文将详细介绍干细胞培养的操作步骤，并分析其中的关键环节。
1. 细胞分离与传代干细胞在培养的过程中，需要定期进行细胞分离与传代，以保持其细胞群体的活力和稳定性。
细胞分离可以采用酶解的方法，通过处理细胞培养物，在细胞间层加入胰蛋白酶等酶类物质，使细胞分散。
分散后的细胞可通过离心等操作，获得细胞沉淀，从而用于细胞传代。
2. 细胞培养物的制备在进行干细胞培养前，需要准备好适合细胞生长的培养基。
常用的培养基有DMEM、MEM和RPMI-1640等。
培养基内通常添加胎牛血清、人血清等添加剂，以提供细胞生长所需的营养和因子。
在制备培养基时，需要注意消毒与无菌操作，以避免细菌污染对细胞培养造成的不良影响。
3. 细胞接种与培养将分散的细胞沉淀加入预先准备好的培养基中，控制细胞密度，通常为每平方厘米约1-2×10^5个细胞。
接种后的培养皿或培养瓶需要放入恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度条件。
此外，还需要提供适当的气体环境，如常规培养箱中的5%CO2和95%空气混合气体。
细胞的培养时间因细胞类型和实验要求而不同，一般为1-2周。
4. 细胞定期观察与检测在细胞培养的过程中，需要进行定期的细胞观察与检测，以评估细胞生长的情况和健康状态。
观察可以通过显微镜、细胞染色和细胞活性试剂等进行，以获得细胞形态、增殖能力和生物学活性等相关信息。
在观察和检测过程中，应注意操作的轻柔与无菌。
5. 干细胞分化与诱导干细胞具有多向分化的潜能，可以不同程度地分化成各种细胞类型。
因此，在培养过程中，可以通过添加特定的生长因子、细胞因子或化学诱导剂，来控制干细胞向特定细胞类型的分化。
分化和诱导的过程通常需要一定的时间和特定的培养条件，如培养基成分的变化和培养环境的调控。
干细胞人工培养与扩增技术操作指南
干细胞人工培养与扩增技术操作指南人工培养和扩增干细胞技术是生物医学领域的重要研究方向之一，它在再生医学、组织工程和药物筛选等领域具有广阔的应用前景。
本文将为您提供一份干细胞人工培养与扩增技术操作指南，旨在帮助您更好地掌握这一重要技术并取得成功的实验结果。
1. 实验前的准备工作在进行干细胞的人工培养与扩增实验之前，您需要做好以下准备工作：1.1 实验室安全确保实验室环境安全无污染，并且具备合适的设备和试剂储存条件。
遵守实验室安全操作规程，佩戴适当的个人防护装备。
1.2 细胞培养物品准备准备培养皿、培养基、血清、抗生素和消毒液等必要的培养物品。
保持试剂的储存温度和pH稳定，确保其质量可靠。
1.3 培养器具准备消毒培养器具，如吸管、移液器等，确保无细菌污染。
同时，备好显微镜、培养箱、细胞培养工作台等实验设备。
1.4 细胞来源确定确定您要培养与扩增的干细胞类型，并选择相应的培养基配方，以支持其生长和增殖。
2. 干细胞培养与扩增的基本技术操作在进行干细胞的人工培养与扩增实验时，需要掌握以下基本技术操作：定期将细胞从一种培养器中传至另一种培养器中，以维持其活力和数量。
传代细胞前应检查细胞密度和培养物条件，确保细胞状态良好。
使用合适的传代倍增因子，不要让细胞过度接触消化液，以避免细胞损伤。
2.2 培养基的配制根据细胞类型选择合适的培养基，并按照配方要求加入适量的血清和生长因子等。
确保培养基pH值的准确度，且培养基应保持在恒定的温度下，通常为37摄氏度。
2.3 培养皿涂层通过在培养皿内涂覆一层适宜的基质，为干细胞提供黏附和生长的支持。
可选择胶原、凝胶和基质蛋白等，根据细胞类型和特点选择合适的涂层材料。
2.4 细胞培养的细节操作-细胞培养器官的平行设计：为细胞提供良好的生长环境，使用合适的培养器官并按照正确的比例进行培养物配比。
-细胞培养的温度和湿度：保持培养环境的稳定性，通常为37摄氏度和5%二氧化碳。
-培养物交换的频率：定期更换新的培养基，以避免细胞毒性物质的积累和营养物质的枯竭。
干细胞培养全攻略
干细胞培养全攻略第一步：准备工作在开始干细胞培养之前，您需要准备一些实验室必需品，如无菌培养器皿、培养基、培养药品和设备。
确保所有的培养物品都是无菌的，以防止任何细菌或真菌的污染。
第二步：细胞分离从组织或器官中获得干细胞是干细胞培养的第一步。
这通常需要对组织进行消化和分离，以获得细胞悬浮液。
消化的方法因组织类型而异，可以使用酶来消化组织，如胰蛋白酶、胶原酶等。
第三步：培养细胞将分离得到的细胞悬浮液培养在无菌培养器皿中。
干细胞可以在不同类型的培养基中生长，包括含有营养物质的基础培养基和添加了细胞生长因子和分化因子的特定培养基。
根据需要，可以选择不同的培养基来促进干细胞的增殖或分化。
第四步：细胞分化干细胞具有自我更新和分化为任何类型细胞的潜能。
要促使干细胞向特定细胞类型分化，可以通过添加特定的分化因子或调节细胞培养条件来实现。
例如，如果要将干细胞分化为神经细胞，可以添加神经生长因子到培养基中。
第五步：细胞鉴定和纯化在干细胞培养过程中，很重要的一步是对细胞进行鉴定和纯化。
这可以通过使用特定的标记物或抗体来检测细胞表面的分子标记完成。
例如，可以使用流式细胞术来分析细胞表面的特定蛋白，从而鉴定和纯化干细胞。
第六步：细胞传代干细胞通常需要定期传代以维持其生长和增殖。
细胞传代是将细胞从旧的培养皿中收集，并将其移植到新的培养皿中的过程。
在传代过程中，确保培养基和设备的无菌性以防止细菌和真菌的污染。
总结干细胞培养是一项复杂的技术，需要严格的实验操作和无菌技术。
在进行干细胞培养时，务必注意细胞的无菌性和培养条件的控制。
同时，在进行细胞分化和纯化时，要使用适当的试剂和方法来鉴定和纯化特定类型的细胞。
干细胞培养需要耐心和经验，但也为细胞生物学研究和医学应用提供了巨大的潜力。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ES 细胞培养
A.FBS的灭活与分装
1.化冻
将血清（Fetal Bovine Serum，Hyclone）从－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜；也可室温（或浸于自来水中）化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存；
2.灭活
（1）放入室温的水浴锅内开始加热（同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准）；
（2）当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟；若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短（比如：不超过5分钟），则仍可使用；
若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME细胞的培养；
（2）取出，自然冷却至室温（约需1－3小时），可分装或－20℃继续冻存；
3.分装
（1）转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；吹出血清时要注意：不要吹出气泡（血清很粘稠，很容易产生气泡；如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下）；标好批号和日期；
（2）放入－20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。
B. 配制DMEM血清培养基
1.提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻；
2.在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），按照比例加入DMEM培养基中，作好标签；放入4℃冰箱保存。
配制比例如下：
C.原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备
1. 取1
2.5-1
3.5dpc孕鼠，断颈处死；
2. 将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；
3. 把平皿转入超净台；
4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；
5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；
6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）；
7. 加入适量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积；
8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；
9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。
10. 将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；
11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；
12. 视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。
饲养层细胞（Feeder）的制备
注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem）
1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10% FBS）；
2. 放入培养箱培养3小时（2－4小时）；
3. 用0.1% 明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；
4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）；
24. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。
ES细胞培养基
DMEM+15%FBS
FBS： gibco Fetal Bovine Serum, ES Cell-Qualified 500ml 10439-024
2-巯基乙醇：5.5uM 1000X Gibco 21985-023
L-谷氨酰胺：2mM 100X Sigma G8540 GluMAX 35050-061(GIBCO)
LIF：1000U/mL 10000X Chemicon ESGRO® (LIF); 10E7 units，货号:ESG1107 非必需氨基酸：100uM 100X Gibco 11140-050
双抗：100X Gibco 15070-063
丙酮酸钠 100x Gibco 11360-070
丝裂霉素： sigma M4287-2MG 1330.29 M4287-5X2MG 5875.74
明胶：sigma G9391 G1393 gelatin solution
胰酶 gibco 15400-054
PBS：14190-144 gibco
TrypLE™ - Phenol Red gibco 500ml 12605-028
DMSO sigma C6164-50ML
ES细胞的复苏
1. 提前制备好相应数量的Feeder；
2. 准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；
3. 转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟；
4. 弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿），补加适量培养液；
5. 转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长情况）。
ES细胞的换液
1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；
2. 细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察（判断生长情况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内；
3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基（6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基）；
4. 放回培养箱继续培养。
ES细胞的传代
1. 前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板；
2. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；
3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出（相差显微镜下作常规观察，Feeder 细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积）；ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少；
4. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜）出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止）；平均分到Feeder培养皿中（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来），滴加补加培养基至5 ml左右（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来；若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右），作好标签；
5. 前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。
ES细胞的冻存
1.常规方法将细胞消化成单细胞悬液；
2.转入试管，1000转/分钟离心5分钟；
3.配适量冻存液（为含10% 二甲亚砜（DMSO），10% FBS的DMEM培养液）；
4.弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液（只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可），转入冻存管，作好标签；
5.放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。