原代细胞培养操作
细胞原代培养实验具体步骤及方法
细胞原代培养实验具体步骤及方法将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。
但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
一、实验材料准备1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至1 000 ml。
Hank's液可以高压灭菌。
4℃下保存。
二、具体操作1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2. 用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。
8. 加入Hank's液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5x105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
注意1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法是指将从活体组织中分离出的未经连续传代或只进行过有限传代的原代细胞，在无菌条件下进行体外培养的技术。
以下是一般的原代细胞培养方法：
1. 组织分离：从生物体中取得需要培养的组织，如肺、肾等。
将组织切碎或用酶消化等方法进行细胞的分离。
2. 细胞悬浮液制备：将分离得到的细胞以适当的培养基和缓冲液混合，形成细胞悬浮液。
3. 培养基准备：根据细胞类型的不同，选择适当的培养基，并添加必要的营养物质、生长因子和抗生素等。
4. 培养皿涂层：将培养皿表面涂覆一层适当的基质，如胶原、明胶等，以促进细胞附着生长。
5. 细胞接种：将细胞悬浮液均匀地加入培养皿中，使细胞附着在培养皿表面。
6. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，控制适当的温度、湿度和气体组成等条件，提供细胞正常生长所需的环境。
7. 培养液更换：定期更换培养液，补充必要的营养物质和生长因子，以保持细胞的生长和增殖。
8. 细胞观察和记录：定期观察和记录细胞的形态、增殖情况和细胞数量等，评估细胞的健康状态。
需要注意的是，不同类型的细胞可能有特定的培养要求，如培养
基成分、pH值、气体组成、温度和湿度等。
因此，在进行原代细胞培养时，应根据具体的细胞类型和研究目的，选择合适的培养条件和方法。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
细胞培养的过程及注意事项
3 6 细胞培养的过程及注意事项细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；（1）基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。
原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。
1、组织块培养法（1）基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。
再用平衡液（PBS）或Hanks 液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。
2、注意事项1）、组织块接种后的前3 天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。
要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事项
请简述细胞原代培养(组织块培养法)的实验步骤及注意事
项
细胞原代培养也被称为组织块培养法，是一种从组织中分离和培养原代细胞的方法。
以下是细胞原代培养的实验步骤和注意事项：
1.组织分离：首先需要从生物体中收集组织样本，如肝、肺、心脏等。
样本需要通过消化或机械分离等方法分离出单个细胞或小组织块。
消化方法可以使用胰酶或胰蛋白酶等酶类来消化样本，机械分离则需要使用切割器或剪刀等工具。
2.细胞培养：分离出的组织块需要在含有营养物质和生长因子的培养基中培养。
在培养过程中需要注意不要过度培养，否则会导致细胞老化或死亡。
3.传代：当细胞达到一定密度时，需要将其分离并移至新的培养皿中进行传代，以维持细胞的生长和繁殖。
注意事项：
1.细胞的培养需要在严格的无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.选择适当的培养基和生长因子，以保证细胞的生长和分化。
3.细胞培养过程中需要定期观察细胞的形态和生长情况，以及细胞浓度，以便及时进行传代。
4.细胞应该在体外保持与体内相似的环境和温度，以提高细胞的存活和生长率。
5.尽量使用新鲜的组织样本，避免长时间冷藏或保存，以保证细胞质量和数量的优良。
原代细胞培养步骤
原代培养(primary culture)，准备工作：A玻璃用品清洁，灭局步骤：1，洗涤剂正常洗刷干净2，放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）3，泡酸（过夜），吸管捆好，做好记录4，捞酸，冲洗干净（注意安全）5，放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）6，包瓶，吸管用棉花塞好，报纸包好，烧杯和配液的瓶子，瓶口内层用硫酸纸，外层用牛皮纸，包好，用线系好7，放入托盘中，200度烤2h（灭菌）8，收集放好B塑料，瓶盖，胶塞清洁处理步骤1，用洗涤剂正常刷洗干净2，晾干，放入酸中，过夜（胶塞除外）3，次日捞出，冲洗干净，过三水（蒸馏水，三蒸水，去离子水）4，放入饭盒中，高压锅，烘干箱，烘干C器械盒（3把剪刀，2把镊子，2个烧杯，2个滤网，2个培养皿）1，洗涤剂冲洗干净2，过三水3，放入饭盒中压，烘干乳鼠心肌原代培养过程：A准备工作：1，剪封口膜（3-4个长的；鼠的只数x2+2的短封口膜）2，器械：平镊，弯镊，剪刀（3把），筛网3，离心管，吸管，平皿1对，50ml烧杯1个，冰袋4，DMEM，DMEM+10%FBS 胰酶（不含EDTA—除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。
）B步骤（一）准备1，将所需的离心管放在试管架上(PS：大概一只心脏一只离心管；多准备3个--2个消化细胞用，一个放混匀用的吸管用)2，点燃酒精灯，依次将吸管打开，加上胶头，并标明吸何种液体，以免操作中混淆（PS：2个吸管--胰酶和混匀用；一个移液管--移取培养液用）3，打开试剂，将其盖，放在远离操作的空间尽量往里4，打开器械，按顺序依次摆放（2把剪刀；一把弯镊）5，用酒精擦试冰袋，打开平皿，并将平皿过火，将平皿放在冰袋上，在每个平皿里加入DMEM(无血清)（二）取乳鼠心脏1，戴无菌手套，将小鼠浸入酒精中消毒，捏抓小鼠背部皮肤，用1st剪刀剪掉头部，然后剪开皮肤，在用2nd剪刀，剪开胸骨（靠左侧点）用镊子夹取心脏，放入DMEM平皿中，注意镊子不要碰到别处。
原代huvec细胞培养注意事项
原代huvec细胞培养注意事项
原代HUVEC细胞是一种常用的血管内皮细胞模型，主要用于研究血管生物学和心血管疾病的发生机制。
在进行HUVEC细胞的培养时，需要注意以下几点。
选择适当的培养基。
常用的HUVEC细胞培养基包括EGM-2和M199等，可以根据实验需要选择合适的培养基。
在培养基中添加适量的胎牛血清或人血清，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。
维持适宜的培养条件。
HUVEC细胞对温度和CO2浓度较为敏感，一般在37摄氏度、5% CO2下培养。
此外，保持培养皿内的湿度也很重要，可以在培养皿内加入一些水或PBS来增加湿度。
注意细胞的传代和增殖。
HUVEC细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到80%到90%时，应及时进行传代。
传代前要用PBS 洗涤细胞，然后使用胰酶将细胞从培养皿上剥离下来，最后用新的培养基重新培养。
注意细胞的纯度和鉴定。
HUVEC细胞的纯度对实验结果的准确性有重要影响，因此需要对细胞进行鉴定。
常用的方法包括免疫细胞化学染色和流式细胞术等。
注意细胞的保存和储存。
HUVEC细胞可以冷冻保存，使用液氮保存细胞可以延长细胞的保存时间，并且可以避免细胞的突变。
在冷冻
保存之前，需要将细胞用含10% DMSO的培养基悬浮，并分装到冻存管中，再放入液氮中保存。
HUVEC细胞的培养需要严格控制培养条件，注意细胞的传代和纯度鉴定，以及细胞的保存和储存。
只有做好这些注意事项，才能保证细胞的正常生长和实验结果的准确性。
细胞原代培养
细胞
一细胞培养
（一）原代培养
○1胰蛋白酶消化法
1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下
3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块过细胞筛，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟
4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀
5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基
7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养
○2组织块法
1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）
2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距
3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养
4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基
仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱
试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
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原代细胞培养操作
取材：
1．用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
2．把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
3．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
4．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
5．剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
用平衡盐溶
液漂洗胚胎至清洗液清亮。
切割（2人一组）：
6．将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
7．然后用眼科手术剪刀小心地反复剪切胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗组织块至清洗液清亮。
8．静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
消化、接种培养（2人一组）：
9．视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液（约3ml），37℃中消化20-40 min，每隔5 min振荡一次。
10．静置，吸去上清，加2ml细胞生长液，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。
11．取部分细胞悬液接种至加了细胞生长液（约3ml）的培养瓶中（若计数，按每细胞瓶1×106细胞的数量接种），置
于37 ℃，二氧化碳培养箱中培养。
培养3～5天观察结果。