布氏杆菌病新型疫苗的研究

布氏杆菌病新型疫苗的研究
立项依据:
布氏杆菌属细菌是一种胞内寄生的革兰氏阴性球杆菌，无芽抱，有荚膜，无鞭毛不能运动，不呈两极染色。

其抵抗力较强，在土壤、毛皮、病畜的脏器及其分泌物中可生存数周至数月。

布氏杆菌可感染多种家畜和野生动物，在我国流行的主要是羊、牛和猪种布氏杆菌，其中以羊种布氏杆菌更多见,临床特征为流产、不孕和睾丸炎。

本病流行广泛，几乎遍布世界各地，在200多个国家中已有170多个国家和地区有人畜布病的存在和流行。

一旦发病，将会造成巨大的经济损失,仅在拉丁美洲，每年造成至少6亿美元的损失，而20世纪90年代美国这一数字平均为1．5亿美元。

在我国该病主要在内蒙古、东北、西北等牧区流行，北方地区也有散发。

布氏杆菌病是一种重要的人兽共患病，严重损害人类健康，主要引起人的流产、睾丸炎、腱鞘炎和关节炎。

人感染布氏杆菌后，不仅需要长时间的抗生素治疗，而且往往会留下严重的后遗症。

世界动物卫生组织(OIE)将布氏杆菌病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病，是国际贸易卫生检疫中必检的传染病。

由于布氏杆菌主要为胞内寄生，抗生素对其效果甚微，一般只有采用活毒疫苗诱导特异性的细胞免疫反应才能产生确实的免疫保护。

因此对布氏杆菌病疫苗的研究主要集中在筛选弱毒株，构建突变株以及寻找亚单位疫苗等方面。

目前国内存在的布氏杆菌病疫苗主要为4种:1、牛种布氏杆菌19，缩写为S19。

自然状
态下布氏杆菌有粗糙型(Rough，R)和光滑型(sm00tll，s)两种，s光滑型细菌细胞壁中含有0链的脂多糖(LPS)，而R型布氏杆菌I粥中的0链缺失。

脂多糖是刺激机体产生抗体的主要有效成分，而O链在血清学诊断中起着重要的作用。

1923年在牛奶中以有毒株发现，但在实验室培养过程中却成为减毒株。

菌体中含有O链的脂多糖（LPS）能持续刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力。

该菌株能传染人，并会引起怀孕母畜的流产，在公畜中也限制使用。

无法区分是自然感染还是人工免疫。

牛流产布氏杆菌S19 弱毒疫苗进行改造，构建成bp26 基因缺失的标记疫苗株，命名为S19-△26。

bp26基因是布氏杆菌特意的基因,与其他细菌没有
同源性.。

bp26蛋白是由bp26基因编码的的250个氨基酸组成,是一种可以由细胞内向外施放的可溶性蛋白.。

BP26 蛋白作为布氏杆菌的一个周质蛋白，对布氏杆菌的毒力不起决定性的作用，但确是布氏杆菌的一个优势抗原，能够诱导高滴度的抗体.S19-△26 与亲本株S19 具有同样的安全性，残留毒力没有发生改变，且同样有抵抗S544强毒菌株攻击的能力。

2、羊种布氏杆菌疫苗，缩写为Rev．1。

Rev．1也是一减毒株，属于光滑型。

对牛、羊布氏杆菌均
具有免疫力和保护力，且对牛的保护力要优于S19。

Rev．1作为疫苗仍具有一定的毒力，并且在适当的条件下，毒力可以完全恢复。

Rev．1对链霉素具有抗性。

因此由其引起的感染往往疗效较差。

Rev．1引起的流产率比S19(S19低于1％)略高。

Rev．1免疫动物后也会干扰临床诊断。

3、猪种布氏杆菌疫苗，缩写为S2。

60和70年代，我国成功研发了猪种布氏杆
菌（S2）疫苗，S2弱毒苗由中国兽医兽药监察所研制，系采用1952年分离自内蒙古的猪源强毒株经培养基连续传代致弱而成，获得了世界上已知毒力最弱的s2毒株，60年代末开始中试，70年代始正式用于羊布氏杆菌的防治。

S2对怀孕母羊安全，不会导致怀孕母畜的流产，可直接通过饮水给苗，保护期长达2～3年。

S2疫苗对猪、牛和羊均能产生良好的免疫,且对
超强毒的马尔他型布氏杆菌的攻击能提供40％～60％的保护。

通过对比试验证明对羊的布氏杆菌免疫保护效果大大优于经典的Rev-1弱毒疫苗株。

由于其毒力较弱，因此在我国被广泛使用。

80年代中期，s2被引入英、法、德、等国.s2株活疫苗对人体具有一定的毒性，对
奶牛场的饲养员、繁殖员和兽医形成潜在的威胁。

s2的保护率较S19和Rev．1低约10％--20％。

4、粗糙型牛种布氏杆菌疫苗，缩写为RB51。

粗糙型牛种布氏杆菌株5l （RB51）最初由光滑型牛布氏杆菌2308株经体外反复传代，并经利福平和青霉素的筛选获得。

具有利福平抗性的RB51是当前应用最为广泛的疫苗。

实践证明其免疫力和保护力均优于S19，具有使用范围广和使用方便等特点。

本疫苗的确定是：菌苗注射法不能用于孕畜及小尾寒羊的免疫，且疫苗的保护力不均，主要对羊和牛有较好的保护力，而对其他动物的保护率较低。

目前我国布氏杆菌疫苗的研究主要是从三个方面进行的。

一是从重组粗糙型布氏杆菌疫苗这一方面进行的。

为了使S型菌从根本上变成R型菌，目前主要是利用分子生物学的方法，破坏或缺失S-LPS合成酶基因。

现已发现与S-LPS合成相关的基因包括：grnd、per、wbkA、wbkC、lpx、wa、wz等，相关的重组菌已构建成功，其毒力和免疫保护试验结果还需大量的动物试验证实。

二是从重组亚单位疫苗方面进行的。

随着布氏杆菌全基因组序列的完成，越来越多的基因功能将被发现，将会有更多可以修饰或改造的基因被利用，为构建具有应用前景的重组布氏杆疫苗株提供了更广泛的资源。

美国学者Vemulapall等在RB51株的基础上，重组进whoA基因，获得重组菌RB5lWboa，该重组菌不仅保留了R型的培养特性，还能够表达O 链抗原，明显增强免疫效果。

由于重组亚单位苗一般以体液免疫为主，对于以细胞内感染为主的布氏杆菌，其能达到的保护效果还需要进一步的探讨。

三是从DNA疫苗方面下手，直接把带有目的抗原基因的重组质粒转染或注射到动物细胞中，使之在细胞内持续表达出天然的抗原物质，这些目的蛋白质经正确的糖基化修饰等加工处理后，与主要组织相容性复合物（MHC）抗原形成复合物并被呈递到细胞表面，诱导特异性细胞毒性T细胞及体液免疫应答。

现阶段研究最多的3种基因为：P39布氏杆菌胞质结合蛋白、Omp3I外膜蛋白3I以及L7／L12核蛋白。

P39是一种良好的T细胞抗原，能够诱发强烈的T细胞反应，但对动物的保护试验远低于S19疫苗。

但如果在P39 DNA疫苗中加入佐剂CpG，则其免疫原性和保护性均有显著提高，甚至和灭活疫苗相当。

Omp3I外膜蛋白3I的研究中，根据分子量大小，布氏杆菌外膜蛋白可分3个组，0mp3l属于31—34kDa组成员，被认为是粗糙型布氏杆菌最重要的保护性抗原蛋白。

用该基因和表达载体构建的重组质粒注入小鼠体内，可产生大量的IgG，且在攻毒时有一定的保护作。

综上所诉，现已经投入生产和大量使用的布氏杆菌疫苗均存在着或多或少的弊端，如保护率不够理想、疫苗不稳定、疫苗存在毒力返祖的风险等等。

而针对亚单位疫苗，由于重组亚单位疫苗一般以体液免疫为主，对于以细胞内感染为主的布氏杆菌，其能达到的保护效果还需要进一步的探讨。

所以对于布氏杆菌新型疫苗的研究主要集中在了研究DNA疫苗上，就目前研究现状而言，至今还没发现一种DNA疫苗可以完全代替死苗和减毒苗。

研究内容:
L7／L12是重要的布氏杆菌免疫优势抗原，在布氏杆菌的几种保护性抗原基因中，以它为基础构建的疫苗对感染具有最显著的抵抗作用。

L7／L12 能特异性地刺激感染动物的单核细胞，并上调INF- γ的转录和表达，从而起保护作用。

首先提取L7／L12基因，并导入质粒，将重组质粒通过转染导入细胞内，使重组质粒能随着细胞的生长、分化而进行复制和增殖，最后表达出需要的蛋白质，刺激机体产生抗体，从而起到疫苗的作用。

研究目标和要解决的关键问题：
选取合适的载体以及细胞的拯救。

实验方案:
1、引物设计与合成,根据 Gene Bank中登录的蛋白编码基因序列，利用软件在线设计引物。

2、目的基因扩增,将目的基因经PCR进行扩增。

反应条件为，94℃，5min，94℃，55s，54℃,45s，
72℃,55s,循环30次，72℃延伸10min结束，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收。

3、目的基因与载体的连接，将测序正确的片段经内切酶处理后与载体连接。

4、重组质粒转染细胞，大量提取重组质粒，过滤除菌。

5、转染细胞的生长和增殖，将处于生长期的细胞接种于25cm2 细胞培养瓶中，24h后在单层
细胞上加入脂质体-质粒混合物,置CO2 孵箱中培养5h后，换上DMEM全培养液，继续培养。

6、重组质粒免疫动物，提取重组质粒纯化后调其质量浓度为1mg/ml ，将5周龄雌性小鼠
分为2组，每组各5只，小鼠左右股四头肌预先注射150g/l 的灭菌蔗糖溶液共100μL ，15min后于实验组注射部位注射质粒100μg/只，对照组注射100μL灭菌生理盐水。

每15d免疫1次，共免疫3次。

7、重组蛋白的表达、鉴定与纯化。

8、动物免疫后的免疫学评价
参考文献。