动物克隆资料

动物克隆

主要结构：

四：介绍动物克隆研究的历史

（动物克隆研究的三个阶段：胚胎细胞克隆阶段、同种体细胞克隆阶段、异种体细胞克隆阶段；其中可以重点找一些比较有名的克隆动物进行详细介绍，比如”克隆羊多莉”等。所提到的克隆动物最好都能附上图片）

五：介绍中国的动物克隆技术研究历史

六：介绍动物克隆技术的方法、环节（看能不能找到视频）

七：动物克隆技术存在的问题（主要是技术方面的缺陷）

四．动物克隆研究的历史

科学家们很早就开始了动物克隆的研究。早在1938 年,德国胚胎学家Spemann 即提出“奇异的实验”的设想。1952 年,英国科学家Briggs 和King首次报道了蛙的核移植研究。1962 年,英国剑桥大学的Gurdon 获得了成年蛙。我国已故科学家童第周教授在20 世纪60 —70 年代曾用囊胚细胞进行鱼类细胞核移植工作,获得属间和种间移核鱼,使我国鱼类核移植研究居世界领先水平。早期的动物克隆研究仅限于两栖类和鱼类,直到20 世纪80 年代,核移植克隆技术才开始应用于哺乳动物。根据供核细胞的不同,可将动物克隆研究分为三个阶段:

1.胚胎细胞克隆阶段

1981 年, Illmensee 和Hoppe 报道了他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为核供体,直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中,重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫,获得克隆小鼠,这是第一次用胚胎细胞对哺乳类进行核移植获得成功。1983 年,美国科学家利用核移植技术和细胞融合方法获得了克隆小鼠。1986 年,英国的Willadsen 用绵羊的8 —16 细胞阶段的胚胎细胞作为供体进行核移植,首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,科学家们又相继克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20 世

纪90 年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。

2.同种体细胞克隆阶段

1997 年2 月,英国罗斯林研究所Wilmut 等人宣布,他们用6 岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植,成功地获得了克隆羊“多莉”。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞,由此说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转, 恢复全能性,这是生物技术史上具有划时代意义的重大突破,是克隆技术的一个里程碑,也改写了部分生物学的理论。1998 年5 月,美国科学家Robl 的研究组利用牛胎儿成纤维细胞克隆出了 3 头牛,而且携带了转移的基因。1998 年7 月,日本科学家Kato 等用牛的输卵管细胞克隆出了8 头小牛。1998 年7 月和1999 年6 月,美国夏威夷大学Yanag2imachi 领导的研究小组克隆小鼠成功,并打破了哺乳动物克隆研究初期人们认为只有雌性动物才能被克隆的迷信。此后,同种体细胞克隆出的山羊、猪、猫和兔也都相继诞生。1999 年和2002年,我国

体细胞克隆山羊和克隆牛也都获得成功。

3.异种体细胞克隆阶段

异种体细胞克隆与同种体细胞克隆的差异在于供核体细胞与受体卵母细胞来源于不同的物种。即将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核(遗传物质) 卵母细胞中。异种克隆研究面临着许多问题,如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期发育? 异种核质能否相容? 异种重构胚能否着床并进行全程发育等。1999 年,中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室将成年大熊猫体细胞作为供核体细胞移植到去核(遗传物质) 的日本大耳白兔卵母细胞中,成功地构建出异种重构胚,体外培养获得孵化囊胚。2001 年将重构胚移植寄母子宫,获得了着床的重大进展。

1999 年,美国Wisconsin2Madison 大学以来自绵羊、猪、猴和大鼠的皮肤成纤维细胞做为供核体细胞,移植到去核(遗传物质) 牛卵母细胞中获成功,表明牛的卵母细胞质可以支持来自不同物种的细胞核进行早期发育;2000 年,Lanza 等人从死亡的濒危牛上取材并培养了皮肤成纤维细胞做为供核体细胞,重构胚移植后,受体最长怀孕至202 天流产,微卫星技术分析证明,所有克隆牛胎儿的基因型均与供体细胞一致;2001 年, Nature Biotechnolo2gy 上报道了异种体细胞克隆濒危哺乳动物———欧洲盘羊的成功,为濒危动物的保护提供了重要的借鉴[5 ] 。随着体细胞克隆技术的发展,它与人类生产和生活的关系也就愈发密切,不同研究领域的科研人员都认识到克隆技术在不同领域的应用前景。

1996年第一只成年体细胞克隆羊“多利”诞生

1997年一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。

1998年两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。

一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠

2000年曾参与克隆“多利”羊的英国公司培育了第一批克隆猪

2001年一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。

2002年法国研究人员克隆出兔子。

2003年美国科学家推出了一匹克隆骡。

爱荷华州的研究人员称他们克隆出了一头濒临灭绝的爪哇野牛。2004年美国加利福尼亚的一家公司培育出了第一只克隆猫。这只猫后来为第一只被卖出的克隆宠物。

2005年韩国科学家宣布他们培育出了首条克隆狗叫“斯纳皮”

克隆羊多莉

1996年7月5日，英国爱丁堡罗斯林研究所（Roslin）的伊恩·维尔穆特（Wilmut）领导的一个科研小组，利用克隆技术培育出一只小母羊。这是世界上第一只用已经分化的成熟的体细胞(乳腺细胞)克隆出的羊。克隆羊多利的诞生，引发了世界范围内关于动物克隆技术的热烈争论。是科学界克隆成就的一大飞跃。它还被美国《科学》杂志评为1997年世界十大科技进步的第一项，也是当年最引人注目的国际新闻之一。科学家们普遍认为，多莉的诞生标志着生物技术新时代来临。继多莉出现后，克隆，这个以前只在科学研究领域出现的术语变得广为人知。克隆猪、克隆猴、克隆牛……纷纷问世，似乎一夜之间，克隆时代已来到人们眼前。

其整个克隆过程简述如下：

步骤一

从一只6岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为A）的乳腺中取出

乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；

步骤二

从一头苏格兰黑面母绵羊（B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；

步骤三

利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”；

步骤四

将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉

总之，多利有3个母亲：它的“基因母亲”是芬兰多塞特白面母绵羊（A）；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其细胞核移植到第二个母亲（借卵母亲）-- 一个剔除细胞核的苏格兰黑脸羊（B）的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎；然后移植到第三头羊（C）--“代孕母亲”子宫内发育形成多莉。

从理论上讲，多莉继承了提供体细胞的那只绵羊（A）的遗传特征，它是一只白脸羊，而不是黑脸羊。分子生物学的测定也表明，它与提供细胞核的那头羊，有完全相同的遗传物质（确切地说，是完全相同的细胞核遗传物质。还有极少量的遗传物质存在于细胞质的线粒体中，遗传自提供卵母细胞的受体），它们就像是一对隔了6年的双胞胎。

多利没有父亲，它是通过无性繁殖--或者说克隆而来。

猪坚强

5?12”汶川地震后，“猪坚强”在被掩埋的极端环境里存活了36天，创造了汶川地震中的生命奇迹，象征了汶川地震中的坚强精神。获救后，“猪坚强”很快恢复了健康。但不幸的是，现年5岁的“猪坚强”地震后完全丧失了生育能力。

为了延续“猪坚强”的优质遗传基因，2011年2月16日，华大基因对“猪坚强”开展耐受性相关分子机制及健康检查研究，获取其耳组织带回华大基因。

科研人员将采集组织培养出成纤维细胞，并采用手工克隆技术将其体细胞进行胚胎克隆，在汶川地震3周年之日即2011年5月12日将克隆胚胎移植入两头健康的代孕母猪受体内。经过110天的体内胚胎发育，代孕母猪于8月31日成功生产出“猪坚强”的复制个体“小猪坚强”。

此次克隆“猪坚强”是首次采用老龄猪体细胞克隆获得成功的事例，也是华大基因手工克隆的一次技术突破，同时展现了华大基因在动物克隆领域走在了国际前沿的技术实力。此前，无论是传统克隆还是手工克隆，所采用的体细胞主要是胎儿成纤维细胞，这是首次应用5岁老龄猪体细胞克隆获得成功。

五．介绍中国的动物克隆技术研究历史

六．动物克隆的方法、环节

目前看比较现实可行的生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。

胚胎分割是把发育不同时期脚台经显微手术切割成几半。每半分别移植,出生多

胞胎动物的过程。

把一细胞至囊胚阶段胚胎一分为二都可形成两个胚胎。在绵羊、猪和牛经胚胎分割都已生出同卵双胞胎后代。

在牛目前胚胎分割已广泛应用半胚移植妊娠率接近整胚。使产犊数几乎加倍。然而，经胚胎分割生的遗传相同个体数有限一般为两个，最多不四个。

细胞核移植是指将发育不同时期胚胎或成体动物细胞核经显微手术和细胞融合的方法移植到去核卵母细胞中重新组成胚胎并使之发育到产仔的过程。

与胚胎分割技术不同。细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术所能够产生的遗传相同个体数目是无限的。

例如，把奶牛的16一细胞期胚胎的16个细胞核，分别移植到16个去核的肉牛卵

母细胞中重新组成16个胚胎。

再把这16个移核胚胎移植到中间受体动物，羊或兔输卵管内。发育到可进行非

手术移植阶段，（桑堪胚或囊胚期）取出并移植到肉牛受体的子宫内。妊娠

后便可产生出数头遗传上完全相同的（克隆）奶牛犊。所出生的这些移核牛之所以遗传上完全相同，是因为其细胞核都来源于同一个胚胎。

如果自中间受体动物输卵管内取出移核囊胚或桑堪胚后不移植到终末受体肉牛的子宫内，而是取其卵裂球细胞核再移植到多个去核的肉牛卵母细胞中便重新组成了第二代移核胚胎。

待第二代移核胚胎发育到囊胚或桑桩胚期时, 又可取其核进行移植。做成第三代移核胚胎、此过程可以无限期地进行下去，不断扩增克隆胚胎的数目最终产生出

许许多多的遗传上完全相同的动物来。

此即所谓的细胞核连续移植技术。

胚胎分割的基本过程

胚胎移入培养液分割胚胎（机械法、酶处理）移植胚胎给受体着床产仔

动物核移植技术程序

胚胎细胞核移植

体细胞核移植

体细胞核移植

七．动物克隆技术存在的问题

1.克隆效率太低, 克隆动物早衰严重

克隆动物健康问题很多, 世界各地的克隆动物流产、夭折、畸形现象都非常严重。核移植总体效率低, 一般仅为1 %～6 % 。这可能与供体核移入受体胞质后的重塑有关。供体核发生去甲基化、去乙酰化等多种变化, 在核重塑过程中基因表达异常都可能导致克隆效率降低。这说明应进一步明确供核基因组的甲基化和乙酰化与核移植胚胎发育的作用机制。克隆动物效率低与核移植胚胎细胞内的染色体异常、胚胎细胞凋亡、胚胎早期死亡、流产、胎盘发育异常有关。重组胚胎的形态、发育潜能与胚胎细胞凋亡, 囊胚的内细胞团之间, 内细胞团同滋养层细胞之间的关系与细胞数量的比例之间关系及发育机制需进一步深入研究。染色体异常与核移植胚胎的妊娠失败和克隆动物的先天性畸形之间的关系尚不清楚。

克隆动物早衰、存活率低现象是当今核移植技术的最大缺陷。而以成年体细胞核作核供体问题尤为严重。它突出表现为: 孕期流产率高, 围产期死亡率高, 新生仔畜体重较重及出生后对环境适应性较差, 出生后发病率高和畸形率高。这可能与核移植技术程序有关, 对细胞膜和细胞超显微结构产生了机械和电击损伤以及一些物质对细胞产生的化学毒害作用, 这些机理需进一步研究。

2.端粒问题

在正常生理条件下的体细胞随着分裂次数的增加, 端粒会逐渐缩短。克隆羊“多莉”细胞端粒较短, 可能影响其寿命。据Shiel s 等报道克隆羊端粒较同年羊的短。Tian 等报道以牛胎儿成纤维细胞作供体的核移植后代端粒比对照组长。Miyashita 等报道克隆个体间端粒长度差异显著。Xu等的研究表明克隆动物端粒长度可以恢复。Lanza 等报道体细胞克隆牛实验过程逆转了供体母牛体细胞的老化, 端粒长度反而增加, 克隆牛寿命延长。Kubota 等指出, 克隆胚胎流产不是端粒长短造成的。这一系列的研究结果表明, 克隆后代端粒长度有差别。端粒长度可能不是造成克隆动物高死亡率的原因。在胚胎发育过程中的端粒机制还有待进一步深入研究。

3.重新编程的问题

重新编程的机制不明, 缺乏基础理论支撑。有些学者认为卵母细胞内有重编程因子存在, 也有学者认为, MPF 和有丝分裂原激活蛋白激酶的活性与重编程没有直接调控关系。重编程程度尚不足以支持着床后胚胎的发育, 需进一步探索核移植后重编程对克隆成功的影响因素。

最近的研究表明, 重编程可能在核移植后的早期就已经启动, 随着胚胎发育逐步深入会造成发育阻断或抑制, 对不同阶段胚胎发育所需的最佳环境培养的深入研究有助于阐明重编程机制。研究表明核移植后细胞核激活与早期胚胎原核发育类似, 但基因组重新编程的机制详细信息尚不清楚。其中, MPF、核膜破裂和早熟染色体凝在基因组重编过程中的作用还需明确。

4.基因印迹机理不清

基因印迹(imprinting) 是同源染色体上基因表达活性不同的遗传现象。基因印迹现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在, 它与胚胎的生长发育和胎盘功能等都有关系。有研究表明被检测的核移植胚胎基因表达不正常, 也有报道核移植胚胎均有几百个非印迹基因表达异常。印迹基因异常表达是造成克隆动物不正常的原因。由此看来, 合子前不完全重新编程影响着印迹基因和大多数非印迹基因的表达, 从而导致克隆动物异常。基因印迹对核移植后基因组重新编程的影响不明确。基因印迹与动物克隆技术的成功及关系值得深入研究。克隆动物种属及其细胞的差异, 不同种属动物的克隆难易不同, 其中的原因目前人们还不清楚。

5.克隆技术条件有待完善

动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大进展, 但该技术目前还很不完善, 克隆机理性的相关理论研究还很薄弱。另外, 克隆胚胎与正常胚胎发育有何异同; 胚胎细胞超显微结构及其功能等; 线粒体与核移植胚胎发育的关系; 细胞核移植的克隆动物在发育生物学中的一些基础问题, 如细胞核质关系、细胞核发育全能性和多能性等, 对这些问题的深入研究, 将有助于加深人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。动物克隆技术的不断完善, 还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。因此, 要提高动物克隆的成功率尚需不懈的努力。