引物及简并引物2013.11.13
引物常识
引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3’-羟基由相配的引物提供。
在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。
在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
1. 不同实验要求的引物选择在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）2.引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。
引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。
引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。
目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，•引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。
较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。
同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。
•平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%～60%之间。
应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
简并引物
简并引物简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。
为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。
简并引物设计的方法简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。
主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。
简并引物设计的常见程序如下：1. 利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA 编码的氨基酸序列。
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。
首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。
随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
2. 对所找到的序列进行多序列比对。
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，网址：http://bioinformatics.weizmann.a ...ww/make_blocks.html。
也可选工具有Clustal W。
3. 确定合适的保守区域。
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有4个氨基酸。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到4个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。
总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。
最终目的就是至少有两个4个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
4. 利用软件设计引物。
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer 5.0进行设计。
但最好使用专门的简并引物设计的方法如：CODEHOP（网址：http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html），GeneFisher2（网址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/）。
简并引物设计过程及原则
简并引物设计过程及原则简并引物常用于从已知蛋白到相关核酸分子的研究及用于一组引物扩增一类分子。
简并引物设计过程（1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。
首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。
随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。
（2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X, 也可在线分析。
所有序列的共有部分将会显示出来。
“*”表示保守，“：”表示次保守。
（3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。
最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
（4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/C/T, B=C/G/T,V=A/C/G, D=A/G/T, N=A/C/G/T, 该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt 区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。
引物的配置标准操作规程
引物的配置标准操作规程引物的配置是分子生物学实验中常用的一项操作，它用于扩增目标DNA片段。
引物的配置标准操作规程主要包括以下几步：第一步：设计引物在进行引物的配置之前，首先需要根据目标DNA序列进行引物的设计。
引物通常由18-25个碱基组成，需要具备以下特点：1. 引物的长度应在18-25个碱基之间，以确保扩增效果的最优化。
2. 引物的GC含量应在40%-60%之间，以确保引物的稳定性和互补性。
3. 引物的Tm值（两股DNA解离中点温度）应在50-65℃之间，以确保合适的扩增温度。
第二步：引物的合成完成引物设计后，需要将引物送至合成顺序。
引物的合成可以委托给专业的合成公司进行，也可以通过自己的实验室进行合成。
合成的引物需要进行纯度检测，确保引物没有杂质和污染物。
第三步：引物的稀释将合成好的引物溶解在无菌纯水中，制备成一定浓度的存储液。
根据具体实验需求，通常可以将引物配置成100μM的浓度。
第四步：引物的保存配置好的引物需要进行适当的保存，以确保引物的稳定性和活性。
通常可以将引物储存在-20℃的冰箱或冻存管中，避免光照和长时间的暴露。
第五步：引物的稀释和配对在进行PCR反应时，需要将引物稀释至适当的浓度，通常可以将100μM的引物稀释成10μM的工作浓度。
同时，需要进行正反向引物的配对，确保引物能够正确结合和扩增目标DNA。
第六步：引物的PCR反应条件设置根据不同的实验目的和目标DNA，需要设置适当的PCR反应条件。
包括扩增温度、时间和循环次数等参数。
一般情况下，引物的扩增温度设置在50-65℃之间，时间设置在30-60s，循环次数根据目标DNA的需求，通常为25-40个循环。
第七步：引物的PCR反应验证配置好引物的PCR反应系统后，需要进行验证实验，确保引物的可靠性和扩增效果。
通过运行PCR反应并进行凝胶电泳分析，观察扩增产物的带型和大小，判断引物配置的准确性和可行性。
最后，根据实验的具体需求和引物的配置情况，可以通过调整PCR反应条件和引物设计来进一步优化引物的效果和稳定性。
引物
记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。
愣是写了一大段的PCR 条件摸索的讨论。
后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。
PCR的第一步就是引物设计了。
引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。
这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。
我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。
高通量芯片应用思路交流会，与专家面对面，不容错过！设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理：①引物长度一般引物长度为18~30碱基。
总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。
有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。
为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
②GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③退火温度退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。
引物常识
引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3’-羟基由相配的引物提供。
在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。
在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
1. 不同实验要求的引物选择在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）2.引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。
引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。
引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。
目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，•引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。
较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。
同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。
•平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%～60%之间。
应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
简并引物文档
简并引物引言简并引物是一种在分子生物学研究和实验室技术中常用的工具。
简并引物是一组具有部分序列差异但具有相似特性的引物序列，用于扩增目标DNA序列。
简并引物通常由多个互补碱基序列组成，这些引物序列可以与目标DNA序列的多个可能序列匹配。
简并引物的广泛应用促进了分子生物学研究的发展，并在基因组学、遗传学和医学诊断中扮演着重要的角色。
简并引物的设计原理简并引物的设计原理基于核酸序列间的碱基互补配对。
在DNA复制和PCR扩增的过程中，引物需要与DNA模板中的特定序列互补，使得DNA聚合酶能够以引物为起始点开始合成新的DNA链。
为了确保引物能够选择性地与目标DNA序列互补，并且不与其他非目标序列互补，简并引物的设计需要考虑到以下几个因素：1.碱基互补：引物序列中的碱基需要与目标DNA序列完全互补，以确保引物能够牢固地结合并启动DNA链的合成过程。
2.简并性：引物序列需要包含多个互补碱基序列，以使得引物能够与目标DNA序列的多个可能序列匹配。
这样的设计可以增加引物与目标DNA序列杂交的特异性和选择性。
3.长度：引物的长度需要适当，一般为15-25个碱基。
过短的引物可能导致非特异性引物杂交，而过长的引物可能影响反应的效率。
4.碱基组成：引物的碱基组成需要均衡，避免引物序列中存在偏向某种碱基的情况。
碱基组成的不均衡可能导致引物的特异性降低。
任何一个简并引物的设计都需要综合考虑以上因素，以确保引物能够准确、特异地扩增目标DNA序列。
简并引物的应用简并引物具有广泛的应用领域，包括但不限于以下几个方面：1.PCR扩增：PCR是分子生物学中最常用的实验技术之一，简并引物在PCR扩增中起到至关重要的作用。
通过使用简并引物，可以扩增出多个不同但相关的目标DNA片段，从而快速、准确地分析目标序列的多态性和变异情况。
2.遗传标记：简并引物可以用于遗传标记的设计和分析。
通过引物的简并性，可以覆盖目标DNA序列的各种可能序列，从而提高遗传标记的准确性和信息量。
简并引物pcr
简并引物pcr概要：本文介绍了简并引物PCR：这是一种用于标记、检测和学习DNA序列的重要策略，它使用简略引物代替标准连接引物，加快了PCR过程，缩短了PCR扩增时间，并且大大降低了PCR扩增成本。
一、简并引物PCR简介简并引物PCR是通过PCR技术，使用简略引物代替标准连接引物，这种新的PCR方法主要是通过改变PCR的引物结构来降低PCR扩增的成本、复杂性和时间。
简并引物PCR也称作橡皮筋PCR，由于简略引物的结构，简并引物PCR类似于橡皮筋，它的两端连接得很紧，也很灵活。
与此同时，简并引物比标准连接引物更容易受到PCR反应缓冲液的稳定，可以安全进行大量PCR扩增和生物信息分析。
二、简并引物PCR的优势（1）简并引物PCR可以大大加快PCR过程，比传统PCR具有更短的时间，缩短了PCR扩增时间。
（2）简并引物PCR减少了PCR扩增成本，竞争性PCR扩增反应只需添加少量简并引物，可以减少更多的核酸对。
（3）简并引物PCR的灵活性更大，可以处理一系列DNA样品，比如，它可以用于鉴定DNA片段的细胞内位置等。
（4）由于更短的引物可能有更高的活性，简并引物PCR可以有效地鉴定和分析目标核酸片段。
三、简并引物PCR的应用简并引物PCR在很多方面展现出巨大的潜力，与其他的PCR技术相比，它有更强的适应性，可以用于：（1）遗传疾病基因检测：简并引物PCR可以用于检测和鉴定遗传疾病的基因变异，例如肿瘤基因的突变、高血压基因的多态性等。
（2）定义DNA片段的细胞位置：PCR可以有效地定义基因和DNA片段在细胞内的位置。
（3）特征型识别：简并引物PCR技术可以有效地识别出具有特征型的DNA序列。
（4）RNA研究：简并引物PCR可以用于研究RNA的表达、多样性和功能。
四、总结简并引物PCR是当今研究DNA序列的重要策略之一，它可以减少PCR扩。
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(4)再利用Oligo6.0进行引物自身的分析:引物自身 有无发夹结构;引物之间有无引物二聚体;引物的 Tm值丌宜过高,且两条引物的Tm值丌要相差5e以 上。
(5) 2条引物间的距离以500~800bp之间为宜,有利于 提高PCR反应的特异性。
常用软件
• Primer Premier 5.0 • Oligo 6.22 • DNAClub • Dnasis • Dnastar • DNAMAN 等
密码子表
简并引物
• 简并引物是指用来编码一段短肽序列的 丌同碱基序列的混合物。 • 主要用来同源克隆未知的基因，或用来 分析某一种基因多态性的一种方法。
• 4、简并引物的筛选 (1)根据引物设计的普遍原则和 Target clamp temper-ature值,先筛选出一些分值较高的引物。
(2)看引物在氨基酸保守区内的位置,确保其简并度 低。 (3)再以其中1条鱼的mRNA序列为模板,利用 DNAMAN看引物在模板中的位置,确定它不模板 mRNA的匹配性,匹配度越高越好。
引物设计原则
• 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27bp，但丌应 大于38 • 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3‘端相似 性较高的序列，否则容易导致错配。 • 引物3’ 端避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC ，会使错误引发机率增加。
• 引物3’端的末位碱基应当避免在引物的3’端使用碱基A 。
简并核苷酸
•R=A/G，Y=C /，M=A/C， K=G/T，S=C/G，W=A/T， H=A/C/T，B=C/G/T， V=A/C/G D=A/G /T， N=A/C/G/T
设计步骤
• 1、利用NCBI搜索丌同物种中同一目的基因的蛋白 或cDNA编码的氨基酸序列。首先找到一种蛋白。 随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白) ，在整个Nr数据库中中查找不之相似的氨基酸序 列。 • 2、对所找到的序列进行多序列比对，确定合适的 保守区域。利用BlockMaker • 3、利用CODEHOP设计引物，从Block Maker Results网页直接登录CODEHOP数据库进行引物 设计。
• 引物二聚体或发夹结构尽量避免。 • 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都丌利于 引发反应。上下游引物的GC含量丌能相差太大。 • • 引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。 • 对引物的修饰一般是在5’端，可以增加酶切位点，荧光标 记等，应根据下一步实验而确定。
其他需要注意的问题:
• a.引物序列应该都是写成5’→3’方向的。 • b.Tm之间的差异最好控制在1度之内。 • c.要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测 将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链 能形成二级结构，就要避开它。 ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物丌能形成二级结构。 ③碱基要随机分布。 ④引物自身丌能有连续4个碱基的互补。 ⑤引物3′端要避开密码子的第3位
Oligo(dT) 随机引物 特异性引物 通用引物 简并引物
引物的稀释
• 收到引物后，在开启离心管盖前在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，以 防开盖时引物干粉散失。引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的 重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。 • 存储浓度一般为100pmol/ul(umol/l) • 工作浓度一般为10pmol/ul(umol/l) • 单位换算1uM=1umol/l=1nmol/ml=1pmol/ul • 例如 配制浓度为Xpmol/ul 加入溶解液的总体积（ul）=nmol（数）×103/X • 终浓度 一般为0.1-0.5uM(浓度高，非特异性强，错配率高)
primer
引物
汇报人：卢玉 婷
定义
• 引物（primer），是一小段单链DNA或 RNA，作为DNA复制的起始点，在核 酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进 行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链 ，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链 形式进行合成，因此引物的3′-OH，必 须是游离的。
种类
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