引物设计步骤与要点
idt设计引物步骤
idt设计引物步骤1. 确定目标序列：首先，我们需要明确实验的目标，即我们想要扩增、克隆或测序的DNA序列。
可以是一个基因、一个特定的DNA 片段或者是整个基因组。
2. 引物长度：接下来，我们需要确定引物的长度。
引物是一小段DNA序列，通常由20-30个核苷酸组成。
引物的长度应该足够短，以便在PCR扩增或测序过程中能够特异性地结合到目标序列上。
3. 引物设计原则：在设计引物时，有一些原则需要遵循。
首先，引物的GC含量应在40-60%之间，这可以增加引物与目标序列的特异性结合。
其次，引物的3'末端应以C或G为主，这有助于避免引物的5'末端的退火。
此外，引物的Tm（退火温度）应在50-65℃之间，以确保引物能够稳定地结合到目标序列上。
4. 引物序列分析：在设计引物之前，我们需要对目标序列进行一些分析。
可以使用一些生物信息学工具，如BLAST，来搜索类似的序列并进行比对。
这可以帮助我们确定引物与目标序列的特异性。
5. 引物设计工具：现在有很多在线工具可以帮助我们设计引物。
这些工具可以根据我们提供的目标序列自动生成合适的引物。
其中一些工具还可以根据特定的实验要求，如PCR扩增、测序或突变分析，进行引物设计。
6. 引物合成：设计好引物后，我们需要将其发送给DNA合成公司进行合成。
在合成引物时，我们需要提供引物的序列、长度和纯度要求。
DNA合成公司将根据我们的要求合成引物，并将其以干燥的形式提供给我们。
7. 引物验证：在使用引物进行实验之前，我们需要对其进行验证。
可以使用一些实验方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、比色法或测序等，来验证引物的纯度和特异性。
总结起来，设计引物是进行各种生物学实验的重要步骤之一。
通过确定目标序列、确定引物长度、遵循引物设计原则、进行引物序列分析、使用引物设计工具、合成引物和验证引物等步骤，我们可以设计出高质量的引物，从而保证实验的成功。
希望本文对你对IDT 设计引物有所了解。
实验一 PCR引物设计
实验一 PCR引物设计姓名：温馨学号：103220 年级：大二专业：生物技术日期：2012/3/18一、实验目的1、掌握PCR引物设计的原则。
2、学会使用PCR引物设计的软件。
二、实验工具OLIGO , DNAMAN三、实验原理聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR 技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法。
PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。
引物设计原则如下：1、引物应在模板cDNA的保守区域设计并具有特异性，与非扩增区无同源序列，这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。
2、引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应3、引物GC含量在40%~60%之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm 为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4、引物中四种碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其3’端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在GC富集序列区域错误引发。
5、引物自身不应存在连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构，从而影响引物与模板的复性结合。
两引物之间也不应具有连续4个碱基的互补，以防止引物二聚体的形成。
6、在引物5’端添加酶切位点时要注意目的序列内不得含有相同的酶切位点，同时在酶切位点外侧加上保护碱基。
四、实验步骤1、打开oligo软件，点击file中的open选项，打开所要用的序列。
引物设计知识点汇总
引物设计知识点汇总引物设计在分子生物学和遗传学研究中起着至关重要的作用。
引物是用于特异性扩增DNA片段的短寡核苷酸序列，需要准确设计以保证扩增效率和特异性。
本文将汇总引物设计的相关知识点，包括引物选择、引物设计策略和引物设计工具等。
一、引物选择引物的选择是引物设计的第一步，关键点如下：1. 引物长度：一般选择18-22个碱基对的短寡核苷酸作为引物长度，过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物则增加了扩增难度。
2. 引物的GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致不稳定的引物结合和扩增效率下降。
3. 引物的翻译调谐能力：引物的序列应尽可能避免出现自身互补的二级结构，避免引物之间的相互结合，以保证扩增特异性。
4. 引物的特异性：引物应具有较高的特异性，即只特异性地扩增目标DNA片段，而不扩增非目标DNA。
二、引物设计策略在引物设计过程中，有以下几种常用的引物设计策略：1. 引物序列比对：将引物序列与目标序列比对，选择引物与目标序列高度互补的区域作为引物的设计区域。
2. 引物性能评估：使用引物设计工具对设计的引物进行性能评估，评估指标包括特异性、互补性、剪切位点等。
3. 引物序列调整：根据引物评估的结果，对引物序列进行调整，如调整引物的长度、GC含量等。
4. 引物结构优化：通过调整引物的二级结构和碱基组成，优化引物的稳定性和特异性。
三、引物设计工具引物设计工具可以帮助研究人员快速设计合适的引物，常见的引物设计工具有：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计软件，提供了丰富的设计选项和参数调整，可以根据用户需求生成高质量的引物序列。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST结合了引物设计和引物特异性评估的功能，能够为用户提供特异性较高的引物设计方案。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer是一款在线工具，可以评估引物的各项性质，如熔解温度、稳定性等。
PCR引物设计
PCR引物设计PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR引物的设计对PCR反应的成功与否至关重要。
下面将详细介绍PCR引物的设计过程。
第一步，选择目标序列。
在设计PCR引物之前，首先需要确定要扩增的目标序列。
目标序列可以来自已知基因的特定片段，也可以通过测序等方法获得。
第二步，引物长度和温度。
PCR引物通常为单链DNA片段，一般长度在18-30个碱基对之间。
引物长度过短容易引起非特异性扩增，引物长度过长则会导致特异性降低。
此外，引物的长度还会影响PCR反应的温度。
一般情况下，引物的长度越长，PCR反应的温度就需要越高。
通常，引物的长度最好在20-24个碱基对之间。
第三步，引物序列的选择。
为了确保PCR反应的特异性，引物的选择至关重要。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基序列，以确保引物能够精确结合到目标序列上。
此外，引物的序列还应避免序列内部的反向重复和结合位点之间的重复序列。
第四步，引物的熔解温度（Tm）的确定。
引物的熔解温度是引物与模板DNA结合的温度。
引物的熔解温度应该尽量接近反应的最低温度，以确保引物能够与目标序列特异性结合。
引物的Tm可以通过以下公式计算：Tm = 69.3 + 0.41 * (G+C%) - 650/length其中G+C%表示引物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分含量，length表示引物的长度。
第五步，特异性分析。
在设计引物之前，可以通过生物信息学工具对引物进行特异性分析。
特异性分析可以通过引物序列与目标序列的比对来进行。
引物在目标序列上应有唯一的结合位点，并且不应该与其他非目标序列有任何重复的位点。
第六步，引物的杂交性能。
为了确保引物的杂交性能，引物应具有适当的糖尖端修饰和杂交性能。
糖尖端修饰可以增强引物的杂交性能，并减少非特异性结合。
此外，引物的GC含量应该适中，过高或过低都可能导致非特异性结合的问题。
第七步，引物的交叉反应。
引物设计的详细步骤
引物设计是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键步骤，以下是引物设计的详细步骤：选择合适的引物长度：通常选择18-30个核苷酸长度的引物。
引物太短可能降低特异性，
而太长则可能导致非特异性结合。
选择合适的引物GC含量：通常选择40%-60%的GC含量。
GC含量过高或过低都可能
影响PCR的效率。
避免引物二聚体和发夹结构：这些结构可能导致引物自身结合，从而影响PCR的效率。
可以使用软件工具检查引物的这种可能性。
避免引物间的互补：引物之间互补的序列可能导致引物结合，从而影响PCR的效率。
选择合适的引物位置：引物应位于目标基因的特异区域，通常选择基因的编码区。
此外，应避免选择有高突变率的区域，这可能影响引物的特异性。
使用软件进行引物设计：有许多在线和离线软件可以帮助设计PCR引物，如Primer3、Oligo 等。
这些软件可以根据输入的基因序列自动设计和选择最佳的引物。
实验验证：即使通过软件设计的引物看起来很好，也需要在实验中进行验证，以确保其特异性、有效性和可靠性。
引物浓度和退火温度的优化：引物的浓度和退火温度也是PCR的重要参数，需要针对特定的反应条件进行优化。
请注意，对于具体的实验和目的，可能需要更具体和详细的设计考虑，建议咨询相关领域的专家或具有丰富经验的实验员。
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤详细步骤如下：步骤一：了解引物设计的基本原理引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。
引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。
因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。
步骤二：确定PCR反应的目标序列在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。
这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。
确定目标序列后，我们可以继续设计引物。
步骤三：确定引物的一些基本参数在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。
这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。
引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。
过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。
GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。
在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。
Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。
Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性以及避免引物形成二聚体。
引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体，从而降低PCR反应的效率和特异性。
步骤四：选择合适的引物设计工具目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。
这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择合适的引物。
此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。
步骤五：进行引物特异性分析设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标序列而不扩增其他非特异性产物。
这可以通过BLAST或其他相似性工具来完成。
特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。
(完整word版)引物设计步骤与要点
引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
引物设计具体步骤
引物设计一、引物设计简介引物设计是以一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的起点而起作用的多核苷酸链。
我们根据根据蛋白的基因序列及所选取的目的片段，设计引物。
二、引物设计的一般原则（一）抗原性：引物设计在完整的Domain区域或者抗原表位集中区域；（二）PCR产物长度：PCR产物长度不应过长，最佳长度为500bp左右。
；（三）长度：15-30bp，其有效长度[Ln＝2(G+C)+(A+T)]一般不大于38，否则PCR 的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃)，从而降低产物的特异性；（四）GC含量：应在40％-60％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5℃；（五）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。
尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发；（六）互补、错配、二级结构：引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
两个引物之间不应有多于4个互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；（七）引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应，应尽量避免3’端发生错配。
而且尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T；（八）特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。
三、常用软件DNAman5，Primer Preimer5，DNAStar/EditSeq、Snapgene四、信息检索常用数据库（一）uniprot（二）ncbi五、引物设计流程以蛋白Actin Beta的Met1-Phe375为例，说明引物设计具体流程：（一）根据蛋白名称或uniprot等信息，点开uniprot数据库；（二）在uniprot数据库中最左侧的菜单栏中，点击“sequence”，找到氨基酸序列；注：若此蛋白有多个isoform，一般以isoform1的序列为准设计引物（三）在“sequence databases”中找到这个蛋白对应的NM号；注：每一个isoform对应唯一一个NM号（四）点击NM号，进入NCBI数据库，找到对应的CD S序列，图中棕色部分即为此蛋白的碱基序列，根据研究需要，截取对应片段长度，如氨基酸片段为1-375，则碱基序列为1-1125；（五）打开Primer Preimer5引物设计软件，输入选取的碱基序列，点击“Primer”示anti-sense；再点击“Edit Primers”进行编辑；（七）当信息栏显示的发夹结构、二聚体、错配等信息为“None”时，初步认为此引物为最佳选择；（八）进入NCBI数据库，点击“BLAST”，选择“Primer-BLAST”，再次分析确认此引物是否为最佳引物。
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引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。
在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。
定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。
引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。
引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。
Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。
可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。
上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。
Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。
第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。
若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。
因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
二、引物设计过程中的心得1、Primer 5.0搜索引物①Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。
当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。
②PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。
至于上限倒也不必要求苛刻。
③Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。
其它参数默认就可以了。
④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。
当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。
对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。
2、Oligo 6.0评估引物①在analyze里，Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。
②Hairpin Formation根据黄金法则③False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。
④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。
在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。
⑤Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。
下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。
△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。
3、其他①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。
这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。
②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。
③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。
软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。
④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。
⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。
所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。