microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明
micrornaprocessing 的过程及其发挥作用的原理;
micrornaprocessing 的过程及其发挥作用的原理;MicroRNA (miRNA) 是一类小而非编码的 RNA 分子，参与调控基因表达的过程。
以下是 miRNA 的加工过程及其发挥作用的基本原理：MicroRNA 加工过程：转录： miRNA 的生成始于 DNA 转录。
miRNA 的前体（pri-miRNA）由RNA 聚合酶II转录，形成包含一段长的带有一房一园结构的 RNA。
剪切： pri-miRNA 被剪切成较短的结构（pre-miRNA）由一种叫做 Drosha 的核酸内切酶进行。
运输到细胞质： pre-miRNA 进入细胞质，并由 Ran-GTP 运输蛋白介导。
再次剪切： 在细胞质中，pre-miRNA 经过 Dicer 酶的再次剪切，形成约 22 核苷酸的双链小 RNA。
miRNA 复合物形成： 这个小 RNA 被合成为 RNA-蛋白质复合物，其中包含 Argonaute 蛋白。
miRNA 导引链选择： 在 miRNA 复合物中，双链小 RNA 中的一条链（导引链）被选择用于结合到 mRNA。
MicroRNA 作用原理：结合靶基因 mRNA： miRNA 复合物通过导引链与靶基因 mRNA 结合。
miRNA 与 mRNA 之间的配对是部分互补的，通常发生在 mRNA 的 3' 未翻译区域（3' UTR）。
抑制翻译： 一旦结合，miRNA 可以通过阻止 mRNA 的翻译来抑制靶基因的表达。
这是通过抑制与核糖体的结合或通过促使 mRNA 降解实现的。
mRNA 降解： miRNA 的结合还可能导致靶基因 mRNA 的降解。
这是通过启动核酸内切酶复合物的活动来实现的。
基因表达调控： miRNA 通过这些机制调控基因表达，对细胞功能和发育过程发挥着重要作用。
总体来说，miRNA 通过抑制或降解与其互补的靶基因 mRNA，起到了基因表达调控的作用。
这种调控对于维持正常的细胞功能和发育至关重要。
microRNA引物设计原则
microRNA引物设计原则引物设计是分子生物学研究中的重要环节，尤其对于微小RNA （microRNA）的研究更是至关重要。
本文将介绍一些关于微小RNA引物设计的原则，以确保实验的准确性和稳定性。
1.引物长度和GC含量：对于微小RNA的引物设计，一般需要选择长度为18-25个核苷酸的序列。
长度过短可能导致引物的特异性不足，而长度过长则会降低引物的亲和力。
此外，引物中的GC含量应适中，通常在40-60%之间，以确保引物的稳定性和特异性。
2.引物的特异性：微小RNA的研究中，引物的特异性非常关键。
为了确保引物只能与目标微小RNA序列结合，并能排除与其他相关RNA的结合，可以利用一些在线工具或软件进行引物特异性分析。
例如，可以使用BLAST（基本局部序列比对工具）来检查引物与其他RNA序列的匹配程度，以确保引物的特异性。
3.引物的稳定性：引物的稳定性也是设计过程中需要考虑的因素。
稳定的引物能够在实验条件下保持其结构和亲和力，从而更好地进行相应的分析。
为了提高引物的稳定性，一般推荐使用纯化的合成DNA或RNA，而避免使用未纯化的引物。
4.引物的结构和碱基互补性：引物的结构和碱基互补性对于实验结果也具有重要影响。
在引物设计中，应避免引物之间的内部、3'或5'端之间的碱基互补性，以免形成二聚体或其他非特异性结合。
此外，还要避免引物中的结构性或碱基偶极性，以免影响引物与目标微小RNA的结合。
5.引物的剪切和扩增效率：在引物设计中，需要考虑引物的剪切和扩增效率。
对于剪切效率，引物的末端序列应选择具有较高的选择性和剪切效率，以确保能够准确地将目标微小RNA分离出来。
而对于扩增效率，引物的选择性和特异性对于PCR反应的稳定性和扩增效率有重要影响。
综上所述，微小RNA引物设计需要考虑引物长度、GC含量、特异性、稳定性以及结构和碱基互补性等因素。
正确的引物设计能够提高实验的准确性和稳定性，进而促进微小RNA的研究和应用。
神师兄教你设计miRNA引物！
神师兄教你设计miRNA引物！近年来测序很火，很多实验室正在或已经完成了sRNA的测序工作，miRNA研究越来越火，然而，找公司设计引物合成引物真心贵（对于我们穷屌丝来说……）。
本人自己动手琢磨了会，哎哟喂~效果良好！好了不闲扯了，下面给大家分享一下我的方法。
miRNA引物设计（茎环法）原理：由于miRNA在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦。
具体操作：需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长miRNA的）、实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物。
1逆转录引物逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成。
“特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。
”5’端茎环结构通常固定，如5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’ ；3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。
即：逆转录引物为“5‘- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGNNNNNNNN-3’（N 为miRNA3’端反向互补的6-8个碱基）。
通俗地说就是，固定的颈环序列（网上很多或者用我这个也行）+miRNA末端6-8个反向互补碱基。
以mmu-[size=14.6666669845581px]miR-16-5p ([size=13.3333330154419px]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)颈环序列+末尾 8个碱基反向互补。
即为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcgccaata [size=13.3333330154419px]2实时定量PCR上游引物上游引物包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。
miRNA引物设计方法
miRNA引物设计方法
一、简介
miRNA引物设计技术是一种用于识别miRNA的分子技术。
miRNA，即microRNA，是一种小RNA分子，可以在细胞表达中作为调控因子发挥作用，因此通过它可以进一步深入研究RNA的功能。
miRNA引物设计技术通过分
析和选择最优的miRNA结合位点来为miRNA定位开发引物，从而对miRNA
的转录进行检测和识别。
1、miRNA数据库
首先，需要建立miRNA数据库，它可以对miRNA的结构和功能进行系
统分析，因此，需要使用一些关键字miRNA的信息，以便以后建立miRNA
的引物库。
同时，还可以了解每个miRNA的表达水平，以便确定miRNA引
物的结构和位点选择。
2、miRNA位点的分析
需要使用相应的软件，如In Silico PCR等，进行miRNA位点的分析，分析结果可以显示miRNA序列的结构特征，以及位点的位置，进而为后续
设计miRNA引物提供必要的信息。
3、miRNA引物的设计
在设计miRNA引物时，需要考虑miRNA引物的链长度、热稳定性和结
合特异性等因素，推荐使用miR primer 3等软件进行miRNA引物的设计，可以比较简便地设计miRNA的引物。
4、miRNA引物的验证
使用miRNA引物进行实验，需要确保其质量，验证的方法有基因芯片验证、PCR产物验证、荧光定量PCR验证等，以确保miRNA引物的准确性和特异性。
三、总结。
microRNA反转和定量引物设计
microRNA反转和定量引物设计microRNA（miRNA）是一类长度约为18-25个核苷酸的小分子非编码RNA，它们能够通过与靶向mRNA配对而引起转录后基因沉默、翻译后调控等作用。
miRNA在生物体内广泛存在，对于肿瘤发生和发展、免疫应答、细胞分化等生物学过程起着重要作用。
首先，让我们来了解一下miRNA反转的原理。
miRNA反转是将miRNA通过逆转录酶酶（Reverse Transcriptase）转录成DNA的过程。
反转录过程中需要两个基本核酸片段：miRNA的反向亚基（RT primer）和反转录引物（RT primer）。
RT基质是由具有未匹配的末端，可以与miRNA互补配对的引物分子。
反转录过程通过与RT引物的匹配，引发RNA链延长的启动，使得miRNA转录成DNA。
这个反应需要RNA酶H（RNase H）的参与来降解RNA模板。
最终通过PCR扩增获得足够的DNA产物用于后续实验。
然后，我们来了解一下miRNA定量引物设计的步骤。
miRNA定量引物设计主要包括两个部分：上游引物和下游引物。
上游引物被设计成能够特异性结合到miRNA的3’端，而下游引物结合到miRNA的5’端。
这样，当PCR扩增时，上下游引物与miRNA的结合使得DNA在目标区域扩增。
设计定量引物需要考虑以下几个因素：1.引物的长度：通常上游引物长度为19-25个核苷酸，下游引物长度为18-22个核苷酸。
引物长度的选择应遵循引物结合的特异性和扩增效率。
2. 引物的Tm值：Tm值是引物与模板的熔解温度。
建议设计上游引物和下游引物的Tm值在55-65℃之间，以提高引物与miRNA的结合特异性。
3. 引物的序列特异性：为了确保引物能够特异性地结合于目标miRNA，应尽量避免引物与其他miRNA或基因组的序列匹配。
4. 引物的其他特性：引物的GC含量、自身二聚体形成和hairpin结构等也需要考虑。
在设计引物时，可以借助一些在线工具和软件，如Primer3、miRprimer和OligoAnalyzer等，这些工具可以帮助用户进行引物设计和评估引物的特性、特异性和二聚体形成等。
microRNA茎环法引物设计及过程原理说明
microRNA茎环法引物设计及过程原理说明微RNA (miRNA) 是一类短RNA分子，主要通过抑制靶基因的转录或翻译来调控基因表达。
茎环法是一种常用的方法，用于设计合成miRNA分子的引物。
miRNA的茎环法引物设计过程包括以下几个步骤：1. 确定目标miRNA序列：首先，需要确定要合成的目标miRNA分子的序列。
这通常可以通过测定和分析细胞中的miRNA表达来获得。
2. 寻找互补序列：在茎环法中，引物包括一个5'端和一个3'端，两端分别与miRNA分子的5'端和3'端互补。
因此，需要在目标miRNA序列中找到一个互补的片段，作为引物的5'端。
3.添加限制性酶切位点：在引物的5'端添加一个限制性酶切位点，以便在后续的实验中方便检测和克隆。
4.茎环结构设计：在引物的3'端设计一个茎环结构。
这通常涉及到在互补序列的两端添加一些碱基，以形成一个稳定的结构。
茎环结构的设计旨在增加引物的稳定性和特异性。
5.引物合成与纯化：设计好的引物可以通过化学合成的方法进行合成。
在引物合成过程中，可以添加适当的保护基团，以避免引物和其他非目标序列的交叉反应。
合成后的引物通常需要经过纯化，以去除杂质和未反应的试剂。
6. 引物验证：合成和纯化后的引物需要进行验证，以确保其与目标miRNA分子的特异性。
常见的验证方法包括原位杂交、荧光探针或靶基因表达的检测等。
茎环法引物设计的原理是基于miRNA与其靶基因的互补配对机制。
miRNA通过与靶基因的mRNA片段互补配对形成复合物，并通过不同的机制抑制靶基因的表达。
由于miRNA分子的长度相对较短，使用整个miRNA分子作为引物可能存在对非目标序列的互补配对，导致特异性降低。
因此，在引物设计中，通过选择与目标miRNA互补的片段，并添加茎环结构，可以提高引物的特异性和稳定性。
另外，茎环法引物设计还需要考虑引物的位置和长度。
microRNA茎环引物设计
microRNA茎环引物设计microRNA（miRNA）是一类由约22个核苷酸组成的小分子RNA，可以在细胞内发挥重要的调节作用。
miRNA通过与靶基因mRNA的互补配对，抑制或降解其目标mRNA，从而调控基因表达。
miRNA的表达水平与许多生物学过程密切相关，包括细胞增殖、分化、凋亡等。
因此，在研究miRNA功能和机制、以及在临床上对miRNA进行检测和干预时，对miRNA的茎环引物进行设计具有重要意义。
miRNA的设计要考虑到两个关键因素：miRNA的序列和其结构。
在miRNA的设计中，通常首先要确认目标miRNA的序列，并考虑到与所需过程相关的miRNA。
例如，如果研究中关注其中一种疾病的miRNA调控，那么需要选择与该疾病相关的miRNA作为研究对象。
选择目标miRNA之后，可以利用计算机软件对其进行预测和分析，找出与之互补的茎环引物序列。
miRNA的茎环引物设计的主要目的是使其能够特异性地与目标miRNA结合，形成稳定的RNA-RNA复合体。
这样可以确保引物能够特异性地识别和抑制目标miRNA，并且能够抵抗给miRNA结构造成的严格限制。
同时，茎环引物的设计还应考虑到引物本身的稳定性和理化性质。
设计miRNA茎环引物的关键是使其与目标miRNA的互补序列能够形成稳定的双链结构。
互补序列的长度应该足够长，以确保引物能够牢固地结合在目标miRNA上，但同时不能太长，以免引物与其他非目标miRNA产生互补配对，造成误差。
此外，引物的GC含量应该在45%左右，以提高引物与目标miRNA的互补性和稳定性。
在miRNA茎环引物设计过程中，还应避免引物与其他RNA或DNA分子的非特异性结合。
为了实现这一点，可以通过引入特殊化学基团或修饰物，如磷酸酯修饰、2'-O甲基修饰等，来提高引物的特异性。
此外，在引物设计中还应考虑引物的长度、序列和稳定性等因素，以得到更好的特异性和稳定性。
总之，miRNA茎环引物的设计是研究miRNA功能和机制、以及在临床上对miRNA进行检测和干预的重要一环。
microRNA过表达载体具体步骤及说明
microRNA过表达载体具体步骤及说明microRNA 过表达载体具体使用说明及步骤MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。
GenePharma MicroRNA 载体利用CMV 启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNase Ⅲ）作用形成small hairpin pre-miRNAs。
在使用载体法针对某一MicroRNA 进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1、实验对照组的确立在一个完善的MicroRNA 表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA 片段；另一种是将目的microRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
对照组的设立对于MicroRNA 表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA 实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。
2、细胞转染条件的确定使用MicroRNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
3、MicroRNA 表达的检测通常用两大类方法来检测MicroRNA 表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA 的变化水平，常用的方法如northern 杂交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA 进行杂交，由于成熟的miRNAs 及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA，导致较高的背景信号。
microRNA正向引物设计及实验操作
microRNA正向引物设计及实验操作一、原理：二、设计过程:已拥有引物：茎环引物（红）、逆向引物（紫）详细过程：1、安装Primer5.0（软件中的复制只能Ctrl+C）2、File—new—DNA sequence，在空白框中输入A（图1）（图1）3、复制要设计的microRNA（let7b：tgaggtagtaggttgtgtggtt），跳出一个选择框，选择Reverse Complemented（图2）（图3）4、在输入的序列后输入几个G，为正链（橙）5’端突出的互补链（图4）5、点击Primer，跳出图5（图5）6、选择Edit Primers，跳出图6（图6）7、删去空白框中的引物，键盘输入Ctrl+C（即复制要设计的microRNA 序列），在跳出的对话框中选择Reversed，随即在False Priming框下出现红色的Found，点击Found，再点击对话框靠右的Primer，出现图7图7 8、在出现的空白框中调节引物的长度和Tm温度：长度通过删除3’端的碱基控制在15-18个，但其Tm值不得少于35度；Tm温度通过5’端加入G或C来调节，尽量控制在56-59度。
9、调节好后的引物点击对话框中的Analyze，分析修改后的引物。
尽量避免引物二聚体（dimer）的3’端的互补。
10、将修改好的引物复制到目标文档中时，注意引物的方向，一般默认为5’端在前，3’端在后。
三、实验操作1、引物原液稀释：（1）拿到引物原液后，先点离，将引物管中的干粉贴到管壁上。
（2）加入相当于引物管中的nmol值的10倍的水（ddH2O或去离子水），例如nmol=24.456，则加入245ul的水。
（3）在引物管上标记引物的名称和稀释后的浓度，按以上方法稀释后的浓度为100umol。
（4）将稀释好的引物储存液混匀，放置一个上午或颠倒混匀一个小时，再将储存液稀释100倍到1umol，即取1ul的储存液加入到99ul 的ddH2O或去离子水中，并做好引物的标记。
microRNA引物设计及过程原理说明
microRNA引物设计及过程原理说明MicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding RNA molecules, typically about 22 nucleotides in length, that play a crucial role in regulating gene expression. They bind tospecific messenger RNA (mRNA) molecules and interfere with their translation or promote their degradation, thereby controlling protein production.The process of designing miRNA primers involves several steps and considerations. Firstly, it is important to identify the target miRNA sequence that you want to amplify. This can be done by mapping the known miRNA sequences to the genome or by searching public miRNA databases. Once the target miRNA sequence is identified, a primer design software or algorithm can be used to generate the primers.There are several criteria that need to be considered when designing miRNA primers. Firstly, the primers should be specific to the target miRNA and should not have significant homology to other miRNAs or non-target RNA molecules. This can be achieved by checking the primer sequence against existing miRNA databases or by performing a BLAST search to identify potential off-target binding sites.Secondly, the primers should have a melting temperature (Tm) within a specific range to ensure optimal binding to the target miRNA. A Tm around 60-70°C is generally preferred. The Tm canbe calculated using thermodynamic parameters, such as the primer sequence and length.Thirdly, the primers should be designed in such a way that they can be easily synthesized and labeled if necessary. This involves selecting appropriate primer lengths and avoiding secondary structures or hairpins that can interfere with primer synthesis or efficiency.Once the primers have been designed, they can be synthesized using standard oligonucleotide synthesis techniques. If necessary, the primers can be labeled with fluorescent or radioisotopic tags for downstream applications, such as quantitative PCR or miRNA expression profiling.In summary, the process of miRNA primer design involves identifying the target miRNA sequence, designing primers that are specific to the target sequence, considering factors such as melting temperature and ease of synthesis, and validating the primers for their effectiveness in specifically amplifying the target miRNA. This process allows researchers to study the expression and function of miRNAs, which can provide valuable insights into gene regulation and disease mechanisms.。
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microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。
首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。
我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。
打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。
颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。
选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。
第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。
下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解
has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU
将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT
miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。
(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授)
has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT
has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC
颈环引物序列：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3’
查看形成的发夹结构（方法前面有讲）
看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：
在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCAT TGTCACACTCCA
查看cDNA结构：
我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA的反转录过程。
下面进入重头戏，教大家如何进行miRNA引物设计。
首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍，如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRAN上查找完整序列。
将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中，然后使用查找替换将U改为T（一定要记住改换，要不然primer5.0是不认U的）。
为了后面引物设计方便，需要以miRNA序列构建引物，所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。
使用primer5.0。
打开File下拉菜单；New；DNA Sequence。
由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来，所以直接操作过程为先将miRNA序列（U改T）输入，再输入颈环结构序列的反向互补序列。
复制miRNA序列（U改T）；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择正向序列。
复制颈环结构序列；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择反向互补序列输入Reverse Complemented。
到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕，下一歩是在primer5.0上进行引物设计。
1.在序列前面输入9个N（这个是个人习惯，也有人是6个或以
上的A，也有人是不输入就直接设计引物的），因为miRNA序列太短，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在
设计正向引物时，一般需要加入3-6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计；
2.点击Function框下的Primer，开始设计上下游引物；
3.有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物，一般使用C
AGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。
同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物；
4.自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物，正好符合先将
常用下游引物输入的操作。
下游引物相当比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。
5.点击框内的Edit Primers；选择所有引物序列；使用组合键
“Ctrl+V”输入下游引物，输入方式为反向输入Reversed；
点击OK；
点击Analyze分析引物基本信息；点击Prime寻找引物在序
列里结合部位；点击OK确定下游引物；
6.点击上下游转换键（图示），开始设计上游引物；点击Edit
Primers；
7.去除前面的9个N；点击Analyze；点击prime；查看前面不
添加序列时的上游引物状况如何。
在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。
8.绝大多数情况下在前边添加的序列已GC为主，且在加GC序
列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高，同理加AT序列。
不要出现GCGC、ATAT、GCCG、或连续4个不同的核苷酸，这些失误会造成引物评分的降低。
个人喜欢加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。
9.例如加入ACGGGC（5’端加入，别在3’端）；点击Analyze；
点击prime；查看引物的长度和TM值差不多了就行。
当然不是全行了，还要查看引物的自身颈环结构，自身引物配对，重要指标为dG（当然还有其他，哈哈）。
下游引物不用看了，因为是经典嘛，呵呵。
点击OK。
10.再查看一下引物对之间的匹对情况，加以对上游引物的修
改，或者更换下游引物。
有必要点击比对框下的All查看所以的匹对情况，呵呵，希望你懂的。
11.想做好实验的同学可以在DNAstar的PrimerSelect中进
一步查看引物对的状况，因为这两款软件让人感觉还是有很大不同的。
例如PrimerSelect中引物的Tm值会比primer5.
0中底5.5度左右（自己可以试一下）；同时PrimerSelect中对5’端中的匹对情况比较放松（可以用经典下游引物CAGTG CAGGGTCCGAGGTAT看一下）；primer5.0中有的dimer在更变或增减个被核苷酸时会不显示，需要PrimerSelect进一步查看完整的dimer。
12.最后说一下，这个文本只是对最基本的miRNA引物设计进
行说明，很多限制没有向大家说明，如果想做实验的可以联系生物公司让他们帮忙设计一下。
或者找比较靠谱的师兄教一下。