microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明
micrornaprocessing 的过程及其发挥作用的原理;
micrornaprocessing 的过程及其发挥作用的原理;MicroRNA (miRNA) 是一类小而非编码的 RNA 分子，参与调控基因表达的过程。
以下是 miRNA 的加工过程及其发挥作用的基本原理：MicroRNA 加工过程：转录： miRNA 的生成始于 DNA 转录。
miRNA 的前体（pri-miRNA）由RNA 聚合酶II转录，形成包含一段长的带有一房一园结构的 RNA。
剪切： pri-miRNA 被剪切成较短的结构（pre-miRNA）由一种叫做 Drosha 的核酸内切酶进行。
运输到细胞质： pre-miRNA 进入细胞质，并由 Ran-GTP 运输蛋白介导。
再次剪切： 在细胞质中，pre-miRNA 经过 Dicer 酶的再次剪切，形成约 22 核苷酸的双链小 RNA。
miRNA 复合物形成： 这个小 RNA 被合成为 RNA-蛋白质复合物，其中包含 Argonaute 蛋白。
miRNA 导引链选择： 在 miRNA 复合物中，双链小 RNA 中的一条链（导引链）被选择用于结合到 mRNA。
MicroRNA 作用原理：结合靶基因 mRNA： miRNA 复合物通过导引链与靶基因 mRNA 结合。
miRNA 与 mRNA 之间的配对是部分互补的，通常发生在 mRNA 的 3' 未翻译区域（3' UTR）。
抑制翻译： 一旦结合，miRNA 可以通过阻止 mRNA 的翻译来抑制靶基因的表达。
这是通过抑制与核糖体的结合或通过促使 mRNA 降解实现的。
mRNA 降解： miRNA 的结合还可能导致靶基因 mRNA 的降解。
这是通过启动核酸内切酶复合物的活动来实现的。
基因表达调控： miRNA 通过这些机制调控基因表达，对细胞功能和发育过程发挥着重要作用。
总体来说，miRNA 通过抑制或降解与其互补的靶基因 mRNA，起到了基因表达调控的作用。
这种调控对于维持正常的细胞功能和发育至关重要。
microRNA引物设计原则
microRNA引物设计原则引物设计是分子生物学研究中的重要环节，尤其对于微小RNA （microRNA）的研究更是至关重要。
本文将介绍一些关于微小RNA引物设计的原则，以确保实验的准确性和稳定性。
1.引物长度和GC含量：对于微小RNA的引物设计，一般需要选择长度为18-25个核苷酸的序列。
长度过短可能导致引物的特异性不足，而长度过长则会降低引物的亲和力。
此外，引物中的GC含量应适中，通常在40-60%之间，以确保引物的稳定性和特异性。
2.引物的特异性：微小RNA的研究中，引物的特异性非常关键。
为了确保引物只能与目标微小RNA序列结合，并能排除与其他相关RNA的结合，可以利用一些在线工具或软件进行引物特异性分析。
例如，可以使用BLAST（基本局部序列比对工具）来检查引物与其他RNA序列的匹配程度，以确保引物的特异性。
3.引物的稳定性：引物的稳定性也是设计过程中需要考虑的因素。
稳定的引物能够在实验条件下保持其结构和亲和力，从而更好地进行相应的分析。
为了提高引物的稳定性，一般推荐使用纯化的合成DNA或RNA，而避免使用未纯化的引物。
4.引物的结构和碱基互补性：引物的结构和碱基互补性对于实验结果也具有重要影响。
在引物设计中，应避免引物之间的内部、3'或5'端之间的碱基互补性，以免形成二聚体或其他非特异性结合。
此外，还要避免引物中的结构性或碱基偶极性，以免影响引物与目标微小RNA的结合。
5.引物的剪切和扩增效率：在引物设计中，需要考虑引物的剪切和扩增效率。
对于剪切效率，引物的末端序列应选择具有较高的选择性和剪切效率，以确保能够准确地将目标微小RNA分离出来。
而对于扩增效率，引物的选择性和特异性对于PCR反应的稳定性和扩增效率有重要影响。
综上所述，微小RNA引物设计需要考虑引物长度、GC含量、特异性、稳定性以及结构和碱基互补性等因素。
正确的引物设计能够提高实验的准确性和稳定性，进而促进微小RNA的研究和应用。
神师兄教你设计miRNA引物！
神师兄教你设计miRNA引物！近年来测序很火，很多实验室正在或已经完成了sRNA的测序工作，miRNA研究越来越火，然而，找公司设计引物合成引物真心贵（对于我们穷屌丝来说……）。
本人自己动手琢磨了会，哎哟喂~效果良好！好了不闲扯了，下面给大家分享一下我的方法。
miRNA引物设计（茎环法）原理：由于miRNA在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦。
具体操作：需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长miRNA的）、实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物。
1逆转录引物逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成。
“特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。
”5’端茎环结构通常固定，如5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’ ；3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。
即：逆转录引物为“5‘- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGNNNNNNNN-3’（N 为miRNA3’端反向互补的6-8个碱基）。
通俗地说就是，固定的颈环序列（网上很多或者用我这个也行）+miRNA末端6-8个反向互补碱基。
以mmu-[size=14.6666669845581px]miR-16-5p ([size=13.3333330154419px]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)颈环序列+末尾 8个碱基反向互补。
即为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcgccaata [size=13.3333330154419px]2实时定量PCR上游引物上游引物包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。
miRNA引物设计方法
miRNA引物设计方法
一、简介
miRNA引物设计技术是一种用于识别miRNA的分子技术。
miRNA，即microRNA，是一种小RNA分子，可以在细胞表达中作为调控因子发挥作用，因此通过它可以进一步深入研究RNA的功能。
miRNA引物设计技术通过分
析和选择最优的miRNA结合位点来为miRNA定位开发引物，从而对miRNA
的转录进行检测和识别。
1、miRNA数据库
首先，需要建立miRNA数据库，它可以对miRNA的结构和功能进行系
统分析，因此，需要使用一些关键字miRNA的信息，以便以后建立miRNA
的引物库。
同时，还可以了解每个miRNA的表达水平，以便确定miRNA引
物的结构和位点选择。
2、miRNA位点的分析
需要使用相应的软件，如In Silico PCR等，进行miRNA位点的分析，分析结果可以显示miRNA序列的结构特征，以及位点的位置，进而为后续
设计miRNA引物提供必要的信息。
3、miRNA引物的设计
在设计miRNA引物时，需要考虑miRNA引物的链长度、热稳定性和结
合特异性等因素，推荐使用miR primer 3等软件进行miRNA引物的设计，可以比较简便地设计miRNA的引物。
4、miRNA引物的验证
使用miRNA引物进行实验，需要确保其质量，验证的方法有基因芯片验证、PCR产物验证、荧光定量PCR验证等，以确保miRNA引物的准确性和特异性。
三、总结。
microRNA反转和定量引物设计
microRNA反转和定量引物设计microRNA（miRNA）是一类长度约为18-25个核苷酸的小分子非编码RNA，它们能够通过与靶向mRNA配对而引起转录后基因沉默、翻译后调控等作用。
miRNA在生物体内广泛存在，对于肿瘤发生和发展、免疫应答、细胞分化等生物学过程起着重要作用。
首先，让我们来了解一下miRNA反转的原理。
miRNA反转是将miRNA通过逆转录酶酶（Reverse Transcriptase）转录成DNA的过程。
反转录过程中需要两个基本核酸片段：miRNA的反向亚基（RT primer）和反转录引物（RT primer）。
RT基质是由具有未匹配的末端，可以与miRNA互补配对的引物分子。
反转录过程通过与RT引物的匹配，引发RNA链延长的启动，使得miRNA转录成DNA。
这个反应需要RNA酶H（RNase H）的参与来降解RNA模板。
最终通过PCR扩增获得足够的DNA产物用于后续实验。
然后，我们来了解一下miRNA定量引物设计的步骤。
miRNA定量引物设计主要包括两个部分：上游引物和下游引物。
上游引物被设计成能够特异性结合到miRNA的3’端，而下游引物结合到miRNA的5’端。
这样，当PCR扩增时，上下游引物与miRNA的结合使得DNA在目标区域扩增。
设计定量引物需要考虑以下几个因素：1.引物的长度：通常上游引物长度为19-25个核苷酸，下游引物长度为18-22个核苷酸。
引物长度的选择应遵循引物结合的特异性和扩增效率。
2. 引物的Tm值：Tm值是引物与模板的熔解温度。
建议设计上游引物和下游引物的Tm值在55-65℃之间，以提高引物与miRNA的结合特异性。
3. 引物的序列特异性：为了确保引物能够特异性地结合于目标miRNA，应尽量避免引物与其他miRNA或基因组的序列匹配。
4. 引物的其他特性：引物的GC含量、自身二聚体形成和hairpin结构等也需要考虑。
在设计引物时，可以借助一些在线工具和软件，如Primer3、miRprimer和OligoAnalyzer等，这些工具可以帮助用户进行引物设计和评估引物的特性、特异性和二聚体形成等。
microRNA茎环法引物设计及过程原理说明
microRNA茎环法引物设计及过程原理说明微RNA (miRNA) 是一类短RNA分子，主要通过抑制靶基因的转录或翻译来调控基因表达。
茎环法是一种常用的方法，用于设计合成miRNA分子的引物。
miRNA的茎环法引物设计过程包括以下几个步骤：1. 确定目标miRNA序列：首先，需要确定要合成的目标miRNA分子的序列。
这通常可以通过测定和分析细胞中的miRNA表达来获得。
2. 寻找互补序列：在茎环法中，引物包括一个5'端和一个3'端，两端分别与miRNA分子的5'端和3'端互补。
因此，需要在目标miRNA序列中找到一个互补的片段，作为引物的5'端。
3.添加限制性酶切位点：在引物的5'端添加一个限制性酶切位点，以便在后续的实验中方便检测和克隆。
4.茎环结构设计：在引物的3'端设计一个茎环结构。
这通常涉及到在互补序列的两端添加一些碱基，以形成一个稳定的结构。
茎环结构的设计旨在增加引物的稳定性和特异性。
5.引物合成与纯化：设计好的引物可以通过化学合成的方法进行合成。
在引物合成过程中，可以添加适当的保护基团，以避免引物和其他非目标序列的交叉反应。
合成后的引物通常需要经过纯化，以去除杂质和未反应的试剂。
6. 引物验证：合成和纯化后的引物需要进行验证，以确保其与目标miRNA分子的特异性。
常见的验证方法包括原位杂交、荧光探针或靶基因表达的检测等。
茎环法引物设计的原理是基于miRNA与其靶基因的互补配对机制。
miRNA通过与靶基因的mRNA片段互补配对形成复合物，并通过不同的机制抑制靶基因的表达。
由于miRNA分子的长度相对较短，使用整个miRNA分子作为引物可能存在对非目标序列的互补配对，导致特异性降低。
因此，在引物设计中，通过选择与目标miRNA互补的片段，并添加茎环结构，可以提高引物的特异性和稳定性。
另外，茎环法引物设计还需要考虑引物的位置和长度。
microRNA茎环引物设计
microRNA茎环引物设计microRNA（miRNA）是一类由约22个核苷酸组成的小分子RNA，可以在细胞内发挥重要的调节作用。
miRNA通过与靶基因mRNA的互补配对，抑制或降解其目标mRNA，从而调控基因表达。
miRNA的表达水平与许多生物学过程密切相关，包括细胞增殖、分化、凋亡等。
因此，在研究miRNA功能和机制、以及在临床上对miRNA进行检测和干预时，对miRNA的茎环引物进行设计具有重要意义。
miRNA的设计要考虑到两个关键因素：miRNA的序列和其结构。
在miRNA的设计中，通常首先要确认目标miRNA的序列，并考虑到与所需过程相关的miRNA。
例如，如果研究中关注其中一种疾病的miRNA调控，那么需要选择与该疾病相关的miRNA作为研究对象。
选择目标miRNA之后，可以利用计算机软件对其进行预测和分析，找出与之互补的茎环引物序列。
miRNA的茎环引物设计的主要目的是使其能够特异性地与目标miRNA结合，形成稳定的RNA-RNA复合体。
这样可以确保引物能够特异性地识别和抑制目标miRNA，并且能够抵抗给miRNA结构造成的严格限制。
同时，茎环引物的设计还应考虑到引物本身的稳定性和理化性质。
设计miRNA茎环引物的关键是使其与目标miRNA的互补序列能够形成稳定的双链结构。
互补序列的长度应该足够长，以确保引物能够牢固地结合在目标miRNA上，但同时不能太长，以免引物与其他非目标miRNA产生互补配对，造成误差。
此外，引物的GC含量应该在45%左右，以提高引物与目标miRNA的互补性和稳定性。
在miRNA茎环引物设计过程中，还应避免引物与其他RNA或DNA分子的非特异性结合。
为了实现这一点，可以通过引入特殊化学基团或修饰物，如磷酸酯修饰、2'-O甲基修饰等，来提高引物的特异性。
此外，在引物设计中还应考虑引物的长度、序列和稳定性等因素，以得到更好的特异性和稳定性。
总之，miRNA茎环引物的设计是研究miRNA功能和机制、以及在临床上对miRNA进行检测和干预的重要一环。
microRNA过表达载体具体步骤及说明
microRNA过表达载体具体步骤及说明microRNA 过表达载体具体使用说明及步骤MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。
GenePharma MicroRNA 载体利用CMV 启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNase Ⅲ）作用形成small hairpin pre-miRNAs。
在使用载体法针对某一MicroRNA 进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1、实验对照组的确立在一个完善的MicroRNA 表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA 片段；另一种是将目的microRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
对照组的设立对于MicroRNA 表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA 实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。
2、细胞转染条件的确定使用MicroRNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
3、MicroRNA 表达的检测通常用两大类方法来检测MicroRNA 表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA 的变化水平，常用的方法如northern 杂交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA 进行杂交，由于成熟的miRNAs 及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA，导致较高的背景信号。
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microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。
首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。
我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。
打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。
颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。
选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。
第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。
下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解
has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU
将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT
miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。
(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授)
has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT
has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC
颈环引物序列：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3’
查看形成的发夹结构（方法前面有讲）
看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：
在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCAT TGTCACACTCCA
查看cDNA结构：
我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA的反转录过程。
下面进入重头戏，教大家如何进行miRNA引物设计。
首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍，如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRAN上查找完整序列。
将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中，然后使用查找替换将U改为T（一定要记住改换，要不然primer5.0是不认U的）。
为了后面引物设计方便，需要以miRNA序列构建引物，所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。
使用primer5.0。
打开File下拉菜单；New；DNA Sequence。
由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来，所以直接操作过程为先将miRNA序列（U改T）输入，再输入颈环结构序列的反向互补序列。
复制miRNA序列（U改T）；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择正向序列。
复制颈环结构序列；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择反向互补序列输入Reverse Complemented。
到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕，下一歩是在primer5.0上进行引物设计。
1.在序列前面输入9个N（这个是个人习惯，也有人是6个或以
上的A，也有人是不输入就直接设计引物的），因为miRNA序列太短，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在
设计正向引物时，一般需要加入3-6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计；
2.点击Function框下的Primer，开始设计上下游引物；
3.有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物，一般使用C
AGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。
同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物；
4.自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物，正好符合先将
常用下游引物输入的操作。
下游引物相当比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。
5.点击框内的Edit Primers；选择所有引物序列；使用组合键
“Ctrl+V”输入下游引物，输入方式为反向输入Reversed；
点击OK；
点击Analyze分析引物基本信息；点击Prime寻找引物在序
列里结合部位；点击OK确定下游引物；
6.点击上下游转换键（图示），开始设计上游引物；点击Edit
Primers；
7.去除前面的9个N；点击Analyze；点击prime；查看前面不
添加序列时的上游引物状况如何。
在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。
8.绝大多数情况下在前边添加的序列已GC为主，且在加GC序
列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高，同理加AT序列。
不要出现GCGC、ATAT、GCCG、或连续4个不同的核苷酸，这些失误会造成引物评分的降低。
个人喜欢加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。
9.例如加入ACGGGC（5’端加入，别在3’端）；点击Analyze；
点击prime；查看引物的长度和TM值差不多了就行。
当然不是全行了，还要查看引物的自身颈环结构，自身引物配对，重要指标为dG（当然还有其他，哈哈）。
下游引物不用看了，因为是经典嘛，呵呵。
点击OK。
10.再查看一下引物对之间的匹对情况，加以对上游引物的修
改，或者更换下游引物。
有必要点击比对框下的All查看所以的匹对情况，呵呵，希望你懂的。
11.想做好实验的同学可以在DNAstar的PrimerSelect中进
一步查看引物对的状况，因为这两款软件让人感觉还是有很大不同的。
例如PrimerSelect中引物的Tm值会比primer5.
0中底5.5度左右（自己可以试一下）；同时PrimerSelect中对5’端中的匹对情况比较放松（可以用经典下游引物CAGTG CAGGGTCCGAGGTAT看一下）；primer5.0中有的dimer在更变或增减个被核苷酸时会不显示，需要PrimerSelect进一步查看完整的dimer。
12.最后说一下，这个文本只是对最基本的miRNA引物设计进
行说明，很多限制没有向大家说明，如果想做实验的可以联系生物公司让他们帮忙设计一下。
或者找比较靠谱的师兄教一下。