引物设计的原理与方法
引物设计原理及详细步骤
2、引物长度一般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm 值5-10℃。
若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4、引物3'端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5、引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
6、碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal /mol）。
引物设计原理
引物设计原理引物设计原理是指利用一种叫做引物的化学物质来控制基因表达的原理。
引物是一种小分子化合物，它可以与DNA或RNA结合，以激活或阻止基因表达。
引物被用于多种应用，包括体外诊断、基因工程、生物技术和分子生物学等。
引物设计是基因工程中一个重要的步骤，它涉及到精心设计、合成和测试引物，以使其能够灵活地与待检测的目标片段结合，并发挥所需的功能。
引物设计的基本原理是：精心设计和合成一种特定的化合物，使其特异性地与感兴趣的目标片段结合，并发挥所需的功能。
引物的作用是将目标片段的复制过程定向激活或阻止，以便达到特定的研究目的。
精心设计引物的基本原理是合成一种适宜大小的化合物，使其能够与特定的目标片段特异性结合，从而激活或阻止特定的基因表达。
要做到这一点，需要考虑三个重要的指标：引物的长度、基序和热稳定性。
引物的长度是指引物的氨基酸数，也就是引物的序列长度。
一般来说，引物的长度应该在18-30个氨基酸之间，这样才能保证引物具有足够的灵敏度和特异性，从而达到最佳的表达效果。
引物的基序决定了它与目标片段的结合特异性。
引物的基序应该完全符合表达目标片段的基序，以确保引物能够特异性地与目标片段结合。
引物的热稳定性决定了它在高温环境中的稳定性，即它能够在高温环境中保持原来的结构和功能。
引物的热稳定性取决于其结构，如基序、碱基对等。
一般来说，引物的热稳定性越高，它在更高的温度下的稳定性就越好。
根据上述原理，引物设计的一般步骤如下：（1）确定目标片段的序列；（2）选择合适的引物长度；（3）设计和合成引物；（4）测试引物的活性和特异性；（5）测试引物的热稳定性；（6）测试引物的灵敏度。
综上所述，引物设计原理是指利用一种叫做引物的化学物质来控制基因表达的原理。
它包括精心设计、合成和测试引物，以使其能够灵活地与待检测的目标片段结合，并发挥所需的功能，从而实现特定的研究目的。
引物设计原理
引物设计原理引物设计是一种在分子生物学中使用的技术，它可以用来控制基因的表达或用于获取某些基因组的一部分分子序列。
因此，引物设计的准确性和特异性非常重要，它可以满足分子生物学研究对高质量特异性DNA序列的需求。
引物设计原理是引物设计的基础，它涉及到基因组学、分子生物学、基因工程等科学领域，是研究引物设计的思路和方法标准。
分子生物学中的引物设计是基因组学研究的重要组成部分，通过建立特异性的引物，可以提高基因表达的特异性和准确性，从而加快对基因的研究和理解。
因此，引物设计的原理和方法是指其能够实现的标准，也是指DNA、RNA以及含有引物序列的模板的分子结构和表达特异性。
引物设计原理的基础是基因组学研究，由基因组学所获得的结果有助于分子生物学研究，特别是在揭示基因的功能和调控机制上。
利用基因组学获取的序列信息，可以设计具有特定功能的引物，如在载体上的引物序列设计、基因的PCR扩增、连锁反应以及基因编辑，都能够从引物设计获得有效的特异性和准确性。
生物信息学技术经常被用于引物设计，通过运用相关的软件和算法，结合基因组序列和已知的信息，可以进行引物设计。
这些软件有很多种，如OptiMAGE、OligoPerfect、PrimerSelect和GeneRunner 等，它们可以提供一些方便的工具来实现特定的引物设计。
此外，引物设计也应考虑到合成能力，即根据特定条件确定的引物的长度、GC含量和结构，以确保引物的有效性和可生物合成性。
一般而言，引物的最佳长度为18-25个核苷酸，其中包含一个或多个T节段，以简化引物合成过程。
引物的GC含量应保持在30-70％之间，并且不应含有太多的碱基重复（优先选择三个及以下的碱基重复），这有助于避免引物的自反应。
最后，引物设计应考虑引物的热稳定性，即引物在特定条件下的稳定性，引物的Tm值（融合温度）应保持在55-65℃，从而保证引物的有效性。
对于一号引物（环状），Tm值应高于3’端，以减少反应体系的复杂性；对于二号引物（键合），Tm值应与一号引物相同或略低，以减少反应体系的复杂性。
PCR引物设计原理
PCR引物设计原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学常用的技术方法，可以通过复制DNA片段来扩增目标DNA序列。
PCR引物是PCR过程中的重要组成部分，其设计合理与否直接影响到PCR的效果。
本文将详细介绍PCR引物设计的原理。
PCR引物是用于扩增目标DNA序列的两条短链DNA片段，通常长度在18至30个核苷酸碱基对之间。
引物设计时需要满足一定的要求，如两个引物的Tm值要相近，避免形成二聚体等。
引物设计的目标是选择能够特异性结合到目标DNA序列的引物，以达到高效、特异性和可重复的扩增效果。
1.引物长度：PCR引物长度通常在18至30个碱基对之间，较短的引物长度可提高PCR扩增效率，但可能导致非特异性结合，较长的引物长度则可提高特异性结合，但降低扩增效率。
2.引物嵌合特性：PCR引物的两端碱基对应目标序列的两端，引物的嵌合特性对PCR效果至关重要。
引物的两端应选择与目标序列互补的碱基，以实现稳定的结合。
此外，还需注意避免引物之间的内部互补结构，以防止引物形成二聚体而影响PCR效果。
3.特异性：PCR引物设计需要确保引物能够特异性结合到目标DNA序列上，而不结合非目标序列。
引物特异性结合的关键在于引物的序列，通过在目标序列上选择特异性的引物序列，可以保证PCR扩增只在目标序列上进行。
4.Tm值：PCR引物设计中，Tm值（熔解温度）是一个重要的参数，表示引物和DNA的双链在扩增温度下脱离为两条单链的温度。
引物的Tm值应在PCR反应的最优温度范围内，通常为50至65摄氏度。
Tm值过低会导致非特异性结合，Tm值过高则可能影响PCR效率。
1.手工设计：手工设计是一种常见的PCR引物设计方法，可以通过参考目标DNA序列的碱基配对规则和特定要求，选择适当长度和特异性的引物序列。
手工设计需要结合生物信息学工具，如序列比对软件和引物设计软件等。
2. 计算机辅助设计：由于手工设计的引物存在一定的主观性，容易出现设计不佳的情况。
引物设计知识点归纳总结
引物设计知识点归纳总结引物设计是分子生物学和基因工程领域中非常重要的一项技术。
合理设计的引物能够用于聚合酶链式反应（PCR）、DNA测序、基因克隆等实验操作，对实验结果的准确性和可靠性起到至关重要的作用。
本文将对引物设计的关键知识点进行归纳总结。
一、引物的基本原理在开始介绍引物设计的具体知识点之前，我们首先需要了解引物的基本原理。
引物是一串能够与目标DNA序列特异性结合的短链核酸分子。
在PCR等实验中，引物通过与DNA序列的互补配对，在酶的催化下引导合成新的DNA链。
因此，引物的设计需要考虑以下几个方面：1. 引物长度：一般来说，引物的长度在18-30个碱基对左右。
过短的引物可能导致非特异性引物结合，而过长的引物则会增加实验成本和复杂性。
2. 引物GC含量：引物的GC含量对引物的特异性和结合稳定性有一定影响。
通常来说，引物的GC含量在40% - 60%之间较为合适。
3. 引物特异性：引物设计的最重要原则是要确保引物与目标DNA序列能够特异性结合。
这就需要通过合理的选择引物序列，避免引物与非目标序列发生配对。
二、引物设计中的重要考虑因素在引物设计中，需要综合考虑多个因素，以确保引物在实验中的成功应用。
以下是引物设计中的一些重要考虑因素：1. 引物的互补性：引物应该具有高度的互补性，即引物序列与目标DNA序列的互补配对部分要尽可能多。
这有助于提高引物与模板DNA 的结合能力。
2. 引物的内部结构：引物在设计时，需避免存在自身内部结合部分，即引物序列中不应出现太多连续的互补序列，以防止引物在实验中形成二聚体或多聚体。
3. 引物的Tm值：引物的熔解温度（Tm值）是指引物与目标DNA序列之间的双链分离温度。
引物的Tm值需要根据所需实验条件和目标DNA序列的碱基组成来确定，以保证引物与目标DNA能够在适当的温度下进行特异性结合。
4. 引物的特异性：在引物设计中，需要进行引物序列的BLAST（基础局部比对搜索工具）检测，以确保引物序列与非目标序列不存在高度相似之处，避免产生假阳性结果。
引物设计的原理与方法
引物设计的原理与方法引物设计是指为了在PCR、荧光定量PCR、基因克隆、基因表达、基因测序等分子生物学实验中特异性地扩增DNA序列或检测特定DNA序列而设计的一对或多对寡核苷酸。
引物设计的原理是基于两个核心要素：特异性和效能性。
特异性指引物与目标DNA序列完全互补，没有或只有微小的不匹配，以确保扩增或检测的特异性；效能性指引物的长度、GC含量、无特异结构和互补等因素需要优化，以提高PCR的效率和产物的质量。
1.模板DNA序列分析：通过对目标DNA序列进行分析，选择合适的扩增区域。
可根据目标序列的功能域、暴露度、多样性等特点进行选择。
2.引物长度和GC含量的优化：引物的长度通常在18-25个核苷酸之间，GC含量一般在40%-60%之间。
过长或过短的引物可能导致特异性和效率下降。
3.引物间的特异性检测：使用基因组数据库进行BLAST或其他比对算法的分析，检测引物是否有特异性。
确保引物的特异性是避免非特异扩增或检测的重要因素。
4. 引物设计软件的应用：目前市场上有很多引物设计软件，如Primer3、Beacon Designer、OligoAnalyzer等。
这些软件通过输入目标序列，自动生成引物并进行特异性和效能性的评估和预测。
5.引物的互补性检测：引物间的互补性会导致多聚体的形成，降低PCR效率和特异性。
可以使用软件或实验方法，如熔解曲线分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，来检测引物间的互补性。
6.实验证明和优化：设计好的引物需要经过实验证明，通过PCR或其他检测方法来验证引物的特异性和效能性。
如果引物不符合要求，可以进行引物的调整和优化。
综上所述，引物设计的原理是基于特异性和效能性，方法包括模板DNA序列分析、引物长度和GC含量的优化、引物间的特异性检测、引物设计软件的应用、引物的互补性检测和实验证明和优化。
这些方法可以帮助科研人员设计特异性和效能性较好的引物，以提高实验的成功率和准确性。
引物设计原理
引物设计原理概述引物设计是在分子生物学和遗传学研究中非常重要的一部分内容。
引物是用于PCR（聚合酶链式反应）、基因克隆和DNA测序等实验中的关键组成部分。
引物的设计必须精确合理，以确保实验的准确性和可重复性。
本文将介绍引物的设计原理以及一些常用的引物设计工具。
引物的定义引物是一段短的DNA或RNA序列，它们与待扩增或待测序的目标序列的两个特定位点相互作用。
在PCR反应中，引物与目标序列的两个末端结合，然后通过聚合酶的作用，在目标序列上合成新的DNA链。
在基因克隆和测序中，引物与目标序列特定区域结合，以实现目标序列的扩增或测序。
引物设计原则引物的设计需要考虑以下几个原则：1. 特异性引物应该具有高度的特异性，即只与目标序列的特定区域相互作用。
这可以通过选择具有较高GC含量的引物来实现，因为高GC含量使引物更稳定，并能够与目标序列更特异地结合。
同时，通过在引物的3’末端引入一些限制性内切酶位点，还可以进一步确保引物的特异性。
2. 避免组内和组间杂交在引物设计过程中，需要避免引物之间的互相杂交以及引物与非目标序列的互相杂交。
互相杂交可能导致非特异性扩增产物的产生，影响实验结果的准确性。
为了避免这种情况的发生，引物设计时需要借助生物信息学工具进行引物比对和引物间互相比对的分析，以确保引物之间没有相互重叠的区域。
3. 合适的长度和温度引物的长度和温度也是引物设计中需要考虑的因素。
通常，引物的长度在18-30个碱基对之间，过长或过短的引物都会导致不理想的扩增效果。
此外，引物的熔点温度（Tm）应该在50-65摄氏度之间，以保证PCR反应的成功进行。
4. 避免引物自身二聚体和非特异性扩增引物自身的二聚体和引物与非特异序列的互相作用可能会导致非特异性扩增，影响实验结果的准确性。
为了避免这种情况的发生，我们需要使用生物信息学工具进行引物序列的分析，确保引物本身不会发生相互结合以及与非特异序列发生结合的情况。
引物设计工具在引物设计中，有许多生物信息学工具可以帮助我们进行引物的选择和优化。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理PCR引物设计原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外迅速扩增DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术手段之一。
而PCR引物设计是PCR技术成功实施的关键，合理的引物设计可以保证PCR反应的准确性和高效性。
本文将介绍PCR引物设计的原理和关键要点。
1. 引物的选择。
在PCR反应中，引物是起到扩增目的DNA片段的作用，因此引物的选择非常重要。
引物通常是由20-30个碱基组成的寡核苷酸，它们分别位于目的DNA片段的两端。
在选择引物时，需要注意以下几点：引物的长度，引物的长度通常在18-25个碱基之间，过长的引物可能会导致非特异性扩增，而过短的引物可能会导致特异性不足。
引物的碱基组成，引物的碱基组成需要符合一定的比例，其中GC含量在40%-60%之间为宜，这样可以保证引物在反应温度下的稳定性和特异性。
引物的特异性，引物需要与目的DNA片段的序列完全匹配，以确保扩增的特异性。
2. 引物的设计。
引物的设计通常是通过计算机软件进行，常用的软件有Primer3、Oligo等。
在设计引物时，需要输入目的DNA片段的序列，软件会根据一定的算法和规则自动生成合适的引物。
在引物设计过程中，需要注意以下几点：引物之间的配对，引物对之间的碱基配对需要避免形成二聚体或者内聚体，这样可以避免引物之间的相互作用影响PCR反应的效果。
引物的位置，引物需要位于目的DNA片段的两端，同时需要避开重复序列或者其他干扰因素，以确保扩增的特异性和准确性。
3. 引物的验证。
设计好引物之后，需要进行一定的验证工作，以确保引物的质量和特异性。
常用的验证方法包括：电泳分析，通过电泳分析引物扩增产物的大小和特异性，可以初步判断引物的质量和特异性。
序列分析，对引物扩增产物进行测序分析，可以确保引物扩增的是目的DNA 片段，而不是其他非特异性产物。
4. 引物的优化。
在实际应用中，有时候设计的引物可能并不能满足要求，需要进行一定的优化工作。
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PCR引物设计的原理及方法阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都610014)摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。
而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。
PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。
引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。
另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。
关键词：PCR 引物原理方法NCBI PrimerPremier5.0PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site.Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。
PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。
具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。
因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。
PCR的第一步就是引物设计。
引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。
成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。
引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。
这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。
我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
1 PCR引物设计的原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
我们先看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
我们可以归纳一下几条PCR引物的设计原则：1.1 避免二聚体与发夹结构引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。
引物设计中，特别需要判断引物互补配对情况是否影响模板与引物的结合，这需要估计模板与引物结合及引物配对结合的自由能。
A、T由2个氢键连接，G、C由3个氢键连接。
一般来说。
出现3个碱基的序列互补便有些危险，尤其在引物3末端。
若3末端出现3个碱基的序列互补或碱基为GC的2个碱基的序列互补。
只好将这个引物放弃，重新设计[3]。
1.2不同物种时避开mRNA的5'和3'末端非翻译区序列在选择用来扩增不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5'和3'末端非翻译区序列。
不同物种mRNA的5'和3'末端非翻译区序列可能没有任何的同源性[4]，如果选择的不同物种DNA序列同源性非常低，那么就无法保证获得一段或几段高度保守的序列，将会为引物设计带来很大的困扰，特别是在BLAST比对和PrimerPremier5.0软件进行评价分析时，各项参数指标将会远远达不到要求，无法充分保证引物设计的高度敏感性和特异性，更会为后期的RT-PCR试验带来诸多麻烦。
1.3不同类型引物设计的特别原则特异性引物的错配率很低，甚至为零，其中，RT-PCR引物最好跨过1个以上的内含子序列；非特异性引物的扩增位点数要在合适范围内；简并性引物的简并性要合适等。
1.4实现以上原则的注意事项（1）引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃不适于Taq DNA聚合酶进行反应[5]。
（2）引物序列在模板内应当没有较高相似性片段，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配[5]。
（3）引物3'端的末位碱基对Taq DNA酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A[6,7]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[5]。
（4）引物序列的GC含量一般为40%-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大[5]。
（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm =4（G+C）+2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法[5]。
（6）△G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3'端△G值较低（绝对值不超过9），而5'端和中间△G值相对较高的引物。
引物的3'端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[8]。
（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
（8）对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
2引物设计的具体方法2.1NCBI搜核苷酸序列登录/GenBank, 可以从GenBank中获取基因序列作为模板。
根据试验要求来确定需要扩增的DNA序列，并知道其编码结构基因区序列。
具体方法如下：在Search对话框中选择Nucleotide在对话框中填人所要查找的Nucleotide名称，如输入CPT，点击Go即得到与CPT相关的许多序列信息，从中选择物种相近的1个，然后将其序列与GenBank中相关序列进行比较[9]。
2.2 序列同源性分析与比较运用DNAStar等相关软件进行序列比较，具体步骤为打开DNAStar，点击MegAlign，在File菜单中选择Eenter Sequences，在查找范围对话框中将上述获得的目的序列复制，点击Done，软件就自动把输入的所有序列进行比较，确定同源性区域。
找出同源性较高的区域，在该区域内选择出引物设计的模板旧，通过以上的计算机操作便可以完成图1所示的序列编辑与处理以及引物设计位置的确定。
2.3 使用PrimerPremier5.0设计引物PrimerPremier5.0是用来设计最适合引物的应用软件，利用其高级引物功能，进行引物数据库搜索、巢式引物设计、引物编辑和分析等，可以设计出有高效扩增能力的理想引物，也可以设计出用于扩增长达5Okb以上的PCR产物的引物序列。
该软件主要由GeneBank序列编辑、Primer引物设计、Align序列比较、Enzyme酶切分析和Motif基序分析等几个主要功能板块组成。
2.4 BLAST比对首先登录http://www.ncbi.nlm.nih．gov，然后点击BLAST；其次进入Nucleotideblast，在Search对话框中将上述获得的序列复制粘贴，点击BLAST，GenBank将自动把输入的序列与序列资源库中所有相关序列进行比较。
在比较结果中列出所有的相关序列比较的情况，当然也包括同一物种不同长度及不同物种已在GenBank中登记的相关基因序列的综合比较。
2.5 筛选后引物的综合评价筛选后引物首先可以在软件上进行分析评价，设计引物的软件一般要具备引物分析评价功能。
各种软件侧重点有所不同，在引物分析评价功能方面，通过综合比较，以Oligo6．0软件最优秀，可快速设计出高成功率的引物[10]。
最后，可以通过PCR扩增后的凝胶成像系统进行试验验证：一是PCR产物的量以及PCR扩增的特异性和效率；二是是否会形成引物二聚体条带；三是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。
3引物设计的展望和相关思考引物设计不仅是PCR的第1步，更是使其成功扩增的关键一步，好的引物不但能避免背景和非特异物的产生，而且也能识别cDNA和基因组模板[11]。
由于基因克隆成功关键步骤就在于PCR反应，扩增产物必须要具备高效性、特异性[12]，所以只有科学严谨地抓住引物设计的每个环节，才会得到最理想的结果。