PCR引物设计与测序结果分析
实验五 PCR引物设计及评价
实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。
2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。
【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。
PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。
引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。
这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。
常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。
过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3’端不可修饰。
引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
pcr技术扩增DNA实验报告
pcr技术扩增DNA实验报告摘要：PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，通过该技术可以在短时间内获得大量特定DNA序列的复制。
本实验旨在使用PCR技术对DNA进行扩增，验证其可行性和准确性。
实验结果表明，PCR技术成功扩增了目标DNA，并呈现出预期的结果。
引言：PCR技术的发明对分子生物学领域做出了巨大贡献。
PCR通过扩增DNA片段来满足各种实验和应用的需求，例如基因克隆、遗传突变检测和DNA起源研究等。
PCR技术的原理基于DNA链的反应性，在特定条件下通过DNA引物、酶和核苷酸扩增目标DNA序列。
本实验旨在验证PCR技术的可行性和准确性，并展示扩增DNA的结果。
材料与方法：材料：1. DNA模板：提供待扩增的DNA样本。
2. 引物：设计用于识别并扩增目标DNA序列的引物。
3. PCR反应液：包含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、镁离子。
4. PCR仪：用于控制PCR反应的温度和时间。
方法：1. 准备PCR反应液：按照指定比例将缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、镁离子混合制备PCR反应液。
2. 加入DNA模板和引物：将待扩增的DNA模板和引物加入PCR反应液中。
3. PCR反应条件设置：根据扩增目标和引物的特性设置PCR反应的温度和时间。
4. PCR反应进行：将PCR反应管放入PCR仪中，进行PCR反应。
5. 扩增产物分析：将PCR反应的产物进行凝胶电泳分析。
结果：经过PCR反应后，我们成功扩增了目标DNA序列，并获得了预期的结果。
凝胶电泳分析显示PCR扩增产物呈现出目标大小的DNA条带，并且PCR扩增产物的浓度较高。
讨论：PCR技术的成功扩增显示了其在分子生物学领域的重要性和应用价值。
通过PCR技术，我们可以在保证准确性和快速性的前提下，生成大量特定DNA序列。
在本实验中，我们通过PCR技术扩增了目标DNA，证明了PCR技术在实验中的可行性和准确性。
此外，本实验还展示了PCR反应条件对扩增结果的重要影响。
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的DNA分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增DNA片段，是许多分子生物学实验的基础。
PCR测序是利用PCR技术对DNA片段进行扩增，并通过测序方法确定DNA序列的过程。
本文将重点介绍PCR测序的原理及其在实验中的应用。
首先，PCR测序需要进行PCR扩增反应。
PCR扩增是通过DNA聚合酶酶和引物（primers）的作用，在一定的温度条件下，对DNA片段进行多轮扩增的过程。
在PCR扩增反应中，引物将与目标DNA序列特异性结合，DNA聚合酶酶则在引物的引导下合成新的DNA链。
经过多轮循环，目标DNA片段将得到显著的扩增。
在PCR扩增反应完成后，接下来就是进行测序。
PCR测序主要有Sanger测序和Next Generation Sequencing（NGS）两种方法。
Sanger测序是第一代测序技术，它利用特殊的二进制缺失核苷酸，将DNA合成链随机终止，从而得到DNA序列信息。
而NGS则是一种高通量测序技术，能够同时对大量的DNA片段进行测序，大大提高了测序的效率。
在Sanger测序中，PCR扩增得到的DNA片段将被用作测序模板。
首先，将DNA片段与引物和特殊的二进制缺失核苷酸一起进行反应，DNA聚合酶将在缺失核苷酸的位置停止合成新的DNA链。
通过对反应产物进行电泳分离，就可以确定DNA序列信息。
而在NGS中，PCR扩增得到的DNA片段将被连接到芯片或固相支持上，形成文库。
接下来，通过特定的测序仪器对文库中的DNA片段进行测序，从而得到大量的DNA序列信息。
总的来说，PCR测序是一种快速、准确的DNA测序方法，广泛应用于基因组学、疾病诊断、药物研发等领域。
通过PCR扩增和测序技术，我们可以快速获取目标DNA片段的序列信息，为科研和临床实践提供了重要的技术支持。
在实验中，PCR测序需要严格控制反应条件和引物设计，以确保扩增和测序的准确性。
miRNA常用实验方法
miRNA常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的realtime-PCR检测方法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计方法：1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。
通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。
因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。
3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。
一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。
2、miRNA反转录miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。
因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。
我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补至10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。
实验二PCR引物设计
5. 上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物 的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形 成引物二聚体。
6. 3’末端 • 3’末端的性质非常关键。 • 不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的
引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生； • 5’端序列添加限制性酶切位点。
二、Primer Premier 软件设计引物
• 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的 软件
• 主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、 primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif
பைடு நூலகம்
正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及 反向互补（reverse complemented ）。
E值越小为好！！
缺失或插入，用“-”来表 示
Query1、2表示输入 的两对引物，Sbjct表 示在库里比对的序列
Degeneracy多义性，尽量减少
GC% 含量：对于 引物多义性，这样会带来更好
PCR 反应来说 GC 的特异性，尽量避免3’末端
含量在50% 左右比 的多义性，因为这个位置即使
较合适。
一个碱基的错配都能阻止引物
（40-60%,45-55%） 延伸。
三、ncbi 在线 primer-Blast 获取候选引物
• 在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： • 例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
• 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’ → 3’。
定量pcr的原理和应用
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
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延伸
从结合在特定 DNA模板上的 引物为出发点 ，按5’→3’的 方向沿着模板 顺序合成新的 DNA链
72˚C
PCR出现的问题：
引物是否合 适?
➢ PCR扩增未得到目的条带？
➢ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性 ）？
➢ 扩增的目的条带很弱？
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环
PCR结果析
引物二聚体
发夹结构
7. 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基 ，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位 点5’端加上适当数量的保护碱基）。
Northern Blot
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
预变性
94oC 5’
模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
变性
在加热或碱性 条件下可使DNA 双螺旋的氢键 断裂，形成单 链DNA
94˚C
退火
模板与引物的 复性,引物是与 模板某区序列 互补的一小段 DNA片段。
正义链
反义链
基本分子生物学研究手段
PCR PCR反应液体的成分:
PCR循环的程序: PCR原理：
基本分子生物学研究手段
RT-PCR
反转录PCR mRNA---cDNA-----PCR
基本分子生物学研究手段
Cutting by enzymes
基本分子生物学研究手段
Southern Blot
基本分子生物学研究手段
PCR引物设计及测序结 果分析
Content
聚合酶链式反应（PCR） 的技术 原理及结果分析
PCR引物设计原理及相关软件的使 用（ Primer Premier 5.0 ）
测序结果分析
一 . PCR的技术原理及结果分析
❖ 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) ，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 ，故又称为基因的体外扩增法。
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平.
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突 变检测的敏感性。
二. PCR引物设计原理及相关软件的使用 （ Primer Premier 5.0 ）
❖ 引物 ❖ 引物的重要性 ❖ 引物设计的原则 ❖ 引物同源性分析 ❖ 引物设计软件 ❖ 如何使用Primer Premier 5.0 ❖ 酶切位点及保护碱基的添加
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上 下游引物的GC含量不能相差太大。
3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。
4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位， 且最好不选择A
5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹 结构；引物自身不能配对，否则易形成约 两个引物长度的引物二聚体；
基本原则：
➢ 引物与模板的序列要紧密互补 ➢ 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构 ➢ 引物不能在模板的非目的位点引发DNA
聚合反应(即错配)。
一般原则：
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在1530bp之间比较合适。
❖ 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃）
❖ Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
❖ PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机 制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这 一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
➢ 各种试剂先进行分装，低温贮存。 ➢ 设置阳性和阴性对照，重复实验
PCR的应用
1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变： 可以随意设计引物在体外对目的基因片段 进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低 ，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中， 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检 测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
引物（primers)
❖ 引物是人工合成的两段寡 核苷酸序列，一个引物与 感兴趣区域一端的一条 DNA模板链互补，另一个 引物与感兴趣区域另一端 的另一条DNA模板链互补 。(上游引物与DNA序列一 致,下游引物要反相互补.)
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
➢ 模板不纯或降解 ➢ Buffer不合适 ➢ 退火温度偏低 ➢ 酶量过多 ➢ dNTP、Mg2+浓度偏高 ➢ 循环次数过多
M12
产物在凝胶上呈Smear状态
4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
交叉污染 对策
➢ 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或 溅出离心管外；
➢ 除不能耐高温的物质外，所有试剂器 材均高压消毒。离心管及枪头等一次 性使用。
PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品）
PCR常见问题
1. 无扩增产物
➢ 模板:含有抑制物，含量低 ➢ Buffer对样品不合适 ➢ 引物设计不当或者发生降解 ➢ 退火温度太高
2. 非特异性扩增
➢ 引物特异性差 ➢ 模板或引物浓度过高 ➢ 酶量过多 ➢ 退火温度偏低 ➢ 循环次数过多
3. 拖尾
引物的重要性
❖ 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的 地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目的DNA结合， PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效的延伸，可见引物设计好坏与 PCR结果密切相关。
引物设计原则
❖ 引物长度 ❖ 碱基分布的均衡性 ❖ Tm值 ❖ 引物二级结构 ❖ 引物3’端 ❖ 引物5’端 ❖ 引物的内部稳定性 ❖ 引物的保守性与特异性 ❖ 扩增区域的二级结构