引物设计和实时荧光定量pcr
荧光定量pcr原理及应用
荧光定量PCR原理及应用一、引言荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA序列并定量测量样品中特定DNA的数量。
本文将深入探讨荧光定量PCR的原理和应用。
二、荧光定量PCR原理2.1 PCR基本原理回顾在了解荧光定量PCR原理前，我们首先回顾一下PCR的基本原理。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的技术，它基于DNA复制的三个基本步骤：变性、引物结合和延伸。
1.变性：将DNA加热到95℃，使其两个链分离成单链。
2.引物结合：将温度降至适合引物结合的温度。
引物是针对待扩增的DNA片段设计的短寡核苷酸序列，它们与待扩增片段的两端互补。
引物结合到待扩增片段上。
3.延伸：在适当的酶的作用下，延伸引物，合成互补链。
通过重复这个循环，DNA片段会指数增加。
2.2 荧光定量PCR原理荧光定量PCR在PCR的基础上进行了改进，引入荧光染料和荧光探针。
荧光染料可以与DNA结合并发出荧光信号，荧光探针可以在PCR过程中实时检测DNA的扩增情况。
1.引物设计：荧光定量PCR需要设计两个引物，一个用于扩增目标DNA，另一个用于扩增内参（house-keeping gene），作为对比和标准。
2.荧光染料：在PCR反应体系中添加荧光染料，如SYBR Green。
SYBR Green可以结合到PCR产物的DNA上，并发出荧光信号。
3.荧光探针：荧光定量PCR还可以使用荧光探针，如TaqMan探针。
TaqMan探针是一种特殊的寡核苷酸序列，它含有两个荧光染料（荧光报告染料和荧光阻断染料）和一个酶切位点。
在PCR反应中，当探针与待扩增片段结合时，酶会切除探针，导致荧光信号的降低。
4.实时检测：荧光定量PCR可以实时检测PCR反应体系中的荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的变化，可以定量测量待扩增片段的数量。
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
实时荧光定量pcr检测核酸的原理
实时荧光定量pcr检测核酸的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。
RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。
引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。
PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。
每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。
RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。
荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。
荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。
当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。
通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。
RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。
首先，需要从待检测样品中提取出核酸。
然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。
接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。
PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。
PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。
最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。
RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。
简述实时荧光定量PCR技术的原理
简述实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的方法。
它结合了传统的PCR技术和荧光探针技术，可以实时监测PCR反应的进程，并根据荧光信号的强度来确定目标物质的数量。
实时荧光定量PCR的原理如下：
1. PCR反应体系：反应体系中包含目标DNA或RNA模板、引物（一对用于扩增目标序列的寡核苷酸片段）、荧光探针和酶。
荧光探针通常由一个与目标序列互补的序列和一个带有荧光物质和荧光物质猝灭物质的序列构成。
2. 扩增过程：PCR反应通过一系列的温度循环来进行。
首先是变性步骤，将DNA 或RNA模板变性为单链。
然后是退火步骤，引物与目标序列互补结合。
最后是延伸步骤，酶在合适的温度下合成新的DNA链。
3. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列的结合会导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测荧光信号的强度，并记录下来。
4. 分析和定量：通过实时荧光定量PCR系统记录的荧光信号强度曲线，可以确定PCR反应的阈值周期数（CT值）。
CT值表示在达到阈值信号强度时，PCR 反应的循环数。
根据CT值，可以计算出目标序列在初始反应体系中的起始数量。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、突变分析等领域。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
荧光定量pcr的原理和过程
荧光定量pcr的原理和过程荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的改进方法，通过引入荧光探针来实现对PCR反应的实时监测和定量分析。
荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等领域，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优势。
荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，都是通过不断复制DNA片段来扩增目标序列。
但是，荧光定量PCR在PCR反应体系中加入了特异性的荧光探针，这种探针能够与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号。
通过实时监测荧光信号的强度，可以准确地定量PCR反应中的目标序列数量。
荧光定量PCR的过程主要包括：样品制备、引物设计、反应体系配置、PCR扩增、荧光信号检测和数据分析等步骤。
首先，样品制备是荧光定量PCR的第一步。
样品可以是DNA、RNA或cDNA等，需要根据实验的目的选择合适的样品类型，并进行样品提取和纯化。
接下来，引物设计是荧光定量PCR的关键步骤之一。
引物是用于扩增目标序列的短DNA片段，通常由两个引物组成：前向引物和反向引物。
引物的设计需要根据目标序列的特点，如长度、GC含量、特异性等进行合理选择，并使用生物信息学工具进行引物序列的合成。
然后，反应体系配置是荧光定量PCR的另一个重要步骤。
反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核苷酸三磷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等组分。
其中，荧光探针是荧光定量PCR的关键组分，它通常由荧光染料和荧光信号抑制剂构成。
荧光染料可以与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号；而荧光信号抑制剂可以抑制未结合的荧光染料发出的背景信号。
接着，进行PCR扩增。
PCR扩增是通过不断循环进行三个温度阶段的反应来扩增目标序列。
首先是变性阶段，将反应体系中的DNA变性为单链DNA；然后是退火阶段，使前向引物和反向引物与目标序列特异性结合；最后是延伸阶段，聚合酶在适当温度下将dNTPs加入到引物结合的DNA链上，从而合成新的DNA链。
实时荧光定量pcr原理
实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的定量分析技术，它结合了PCR技术和实时荧光检测技术，可以实现对目标序列的快速、准确和高灵敏度的定量检测。
本文将介绍实时荧光定量PCR的原理及其在科研和临床诊断中的应用。
首先，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合。
在PCR过程中，DNA或RNA模板会被特异性引物引导进行扩增，同时荧光探针与目标序列结合并释放出荧光信号。
随着PCR的进行，目标序列的数量会不断增加，荧光信号也会随之增加。
利用荧光检测仪器可以实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度，从而实现对PCR反应过程的实时监测和定量分析。
实时荧光定量PCR的优势在于其高灵敏度、高特异性和高准确性。
相比于传统的终点荧光定量PCR，实时荧光定量PCR可以在PCR反应过程中实时监测目标序列的扩增情况，从而可以准确地确定起始模板的数量。
此外，实时荧光定量PCR还可以通过荧光探针的设计实现多重PCR反应的同时检测，大大提高了检测的通量和效率。
在科研领域，实时荧光定量PCR被广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、基因突变分析等领域。
通过实时监测PCR反应过程中的荧光信号，可以准确地确定不同样本中目标基因的表达水平，从而揭示基因在生理和病理过程中的作用。
在临床诊断中，实时荧光定量PCR也被用于病原微生物的检测和基因突变的筛查，其高灵敏度和高特异性使其成为临床诊断的重要辅助手段。
总之，实时荧光定量PCR作为一种高效、准确的定量分析技术，已经成为科研和临床诊断中不可或缺的工具。
其原理简单、操作方便，可以快速、准确地实现对DNA或RNA的定量分析。
随着技术的不断进步和发展，相信实时荧光定量PCR在科研和临床诊断中的应用前景将更加广阔。
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荧光不会产生荧光的交叉干扰
3、荧光定量PCR的化学基础
目前常用的几种荧光物质 （1）、Taqman探针类
5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探 针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光； 探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因 互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶5’---3’外切酶的作用下， 探针水解断裂，荧光产生。
6、双链核酸的熔解曲线分析
对于核酸序列相同的PCR产物，其TM值也相同，而且其TM值在一个很小 的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强 度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图：
6、双链核酸的熔解曲线分析
上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核 酸双链，在一定的离子强度下的TM值。核酸双链的TM值由双链 核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其TM值也不 同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生 型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染 料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也 能分析出来。
（2）、2 -△△CT法 该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1， 在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩 增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方 法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。
7、mRNA差异表达的相对定量分析
（2）、2 -△△CT法
1、荧光定量PCR技术概论
荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技 术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进 行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短
短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为
分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。
1、荧光定量PCR技术概论
3、荧光定量PCR的化学基础
Taqman探针的特点及应用 （1）、特异性强、准确性高
本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异 性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCR产物 的量成正比关系，因此准确性极高。 （2）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的Taq酶就能满足实验的要求。 （3）、常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝) 及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变 化）。 （4）、目前价格也不是太贵，2OD 1000.00左右
5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析
CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) –lg Rs
（1）、PCR效率相等，在PCR扩增的指数期，E稳定且为常数；
（2）、RT –RB 要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧
光本底之差要相等；
（3）、样品的单位信号强度Rs要相等，用荧光染料做荧光基团时，Rs 就
5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析
LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上 计算出未知样品初始模板量。
6、双链核酸的熔解曲线分析
使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着PCR反应的进 行，双链PCR产物呈指数增长，SYBR GreenⅠ与双链PCR产物结合后荧光越 来越强，当PCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时对PCR产物进行缓慢 加热，从50℃一直加热到99℃，在此过程中PCR产物按照TM值的大小双链被 依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：
荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通 过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。
系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。
常规PCRvs实时PCR
• 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性 分析
4、荧光定量PCR的数学原理
当循环数n等于CT值时，所有样品荧光信号强度变化量的 对数全部一致，都达到了阈值。
RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT -RB) = lgX0 + CT lgC(T 1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) –lg Rs
（2）、阈值线 在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，
所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。
2、荧光定量PCR常用的三个概念
（3）、CT值
PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的 扩增循环数。
3、荧光定量PCR的化学基础
荧光定量PCR是随着PCR循环的进行，以荧光信号强度的积 累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特 点： （1）、本底低 （2）、荧光强度高 （3）、每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧
3、荧光定量PCR的化学基础
Taqman常用的荧光基团和淬灭基团
荧光基团：5’端常用荧光基团FAM标记，最佳激发光波长：494-495nm，最大 发射光波长：518-520nm。
淬灭基团：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。 TAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500— 560nm，最佳激发光波长在560nm附近，对FAM基团产生的发射光 具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560—650nm，当做 多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已 不常用。 BHQ和ECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会 产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较 为常用，尤其在多重荧光定量PCR时常常被采用。
该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。
18srRNA基因等。
7、mRNA差异表达的相对定量分析
以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两 种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-delta Ct法。
7、mRNA差异表达的相对定量分析
（1）、双标准曲线法 所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对 定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相 对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。
3、荧光定量PCR的化学基础
（2）、荧光染料类 目前常用的荧光染料为SYBR GreenⅠ、SYBR GreenⅡ、 SYTO9、HRM等。其共同性质为： （a）、结合于双链核酸的小沟处 （b）、与双链DNA结合后受激产生荧光 （c）、在变性条件下双链分开，荧光消失
3、荧光定量PCR的学基础
荧光染料的特点及应用
左图横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn，改图反映的是各个样品随着 每轮PCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是 总的荧光强度与荧光本底的差值RT –RB即△Rn的对数，在右图中确定阈值线，该直 线上所有样品的RT –RB的对数都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。
是每条PCR产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和
PCR产物的长短有关，PCR产物越长，结合的荧光染料越多， Rs 值 越大；用探针做荧光基团时，Rs 就等于PCR反应时，Taq酶水解掉
探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和PCR产物的长度没有 直接关系。
5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析
此时，PCR反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率E稳定且近似相
等； lg(RT -RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0为变量，且这两个变
量之间成一次性方程。
也就是说， 所有样品的lgX0与到达阈值时的循环数n（Ct值）呈线性
关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模 板量
两种化学试剂的比较
化学试剂
工作原理
有否淬灭剂
SYBR Green I
结合于双链DNA 否 的小沟中
信号检测阶段 延伸
TaqMan
水解型杂交探针 有 （5‘-3’外切）
任何步骤
4、荧光定量PCR的数学原理
对于普通的PCR反应来说
Xn=X0（1＋E）n
上式中， Xn为n轮PCR循环后，目的基因PCR产物的量；n为 PCR循环数；X0 为目的基因的初始模板量，E为PCR的反应效 率，0≤E≤1。
该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在 试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的 差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且 在接下来的实验中，无需再做标准品。
该方法要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结 果就会有很大的差别。
温州医科大学附属第二医院科研中心 葛仁山 2014.8.4
目录
一、荧光定量PCR技术的基础理论 二、引物的设计及原则 三、内参基因的选择 四、定量PCR的实验设计和数据处理 五、实时定量PCR两种相对定量方法比较 六、误差分析及操作规范 七、实验中污染的防控 八、实验结果的分析
一、荧光定量PCR技术的基础理论
左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指 数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右 图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都 采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。
2、荧光定量PCR常用的三个概念