实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。
实时荧光定量PCR技术实验操作流程
实时荧光定量PCR技术实验操作流程
1.RNA提取：
针对茎环状结构RT引物，RNA正常提取就好;对于Oligod(T)特异的RT引物，尽量用特殊试剂盒提取miRNA。
2.反转录：
反转录过程对酶没有特殊要求，操作按照反转录酶的说明书进行。
对于引物，在反转录过程中只需加入Oligod(T)特异的RT引物或茎环状结构RT引物，不需要另外添加其他RT引物。
用Oligod(T)特异的RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。
内参基因不需要单独设计RT引物，可以用荧光定量PCR的反向引物作为RT引物。
3.荧光定量PCR：
先优化PCR体系(引物浓度、退火温度等)，进行引物测试，确保扩增曲线正常且溶解曲线为单一的尖峰，阴性对照无扩增，则引物测试合格，再进行后续实验(常规操作)。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
实时荧光定量PCR操作指南
实时荧光定量PCR操作指南实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达、病毒检测、疾病诊断等领域。
本文将为您提供一份详细的实时荧光定量PCR操作指南，以帮助您正确高效地进行实验。
一、前期准备1.仪器准备确保实时荧光定量PCR仪的工作状态正常，能够提供稳定的温控和荧光检测功能。
2.试剂准备准备好使用的引物和探针、反转录酶、核酸模板、PCR酶、荧光探针等试剂，并按照相关说明进行稀释和储存。
3.实验室操作保持实验室环境清洁整洁，确保试剂和样品不受外界污染。
佩戴实验手套和口罩，避免DNA污染。
二、PCR体系设置根据您的实验目的和试剂系统的要求，设置PCR反应的体积和组分。
1.配置PCR体系a.将反向转录试剂盒中的试剂按照说明书中的比例进行配置，包括引物、探针、反转录酶、核酸模板等。
b.添加核酸模板到体系中，确保模板的质量和浓度适合实验要求。
c.添加合适的PCR酶，如Taq DNA聚合酶、Platinum Taq DNA聚合酶等。
d.添加稀释的胶原酶。
2.装管设置a.在无菌条件下，将PCR反应体系分装至PCR管中。
b.避免气泡的产生，确保体系均匀混合。
三、PCR参数设置根据实验需求和试剂系统的建议，设置PCR反应的温度和时间参数。
1.反转录步骤a.按照试剂盒说明书的建议，设置反转录温度和时间。
常见的反转录参数为42℃，60分钟。
2.PCR扩增步骤a.设置初始变性温度和时间。
常见的初始变性参数为95℃，5分钟。
b.设置PCR循环数和每个循环的温度和时间。
常见的PCR循环参数为95℃，15秒；60℃，1分钟，共40个循环。
c.设置荧光检测温度和时间。
根据荧光探针的特性，设置合适的温度和时间窗口。
四、数据分析和结果解读1.数据采集实时荧光定量PCR仪会自动记录荧光信号和温度变化数据，确保您保存这些数据供后续分析和结果解读使用。
qpcr的操作流程
qpcr的操作流程
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、准确的分子生物学技朧，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。
下面将介绍qPCR的操作流程。
1. 样品处理：首先需要从样品中提取RNA或DNA，并进行适当
的纯化处理。
确保提取的核酸质量和浓度符合实验要求。
2. 质控检测：对提取的核酸进行质控检测，包括测定纯度、浓
度和完整性。
确保核酸的质量符合实验要求。
3. 反转录：对RNA进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。
反
转录反应需要使用逆转录酶和引物，确保反转录产物的质量和完整性。
4. 准备qPCR反应体系：根据实验设计和引物设计，准备qPCR
反应体系。
包括模板DNA或cDNA、引物、探针、核酸酶、缓冲液等。
确保反应体系的配比准确。
5. 进行qPCR反应：将准备好的反应体系加入到qPCR仪器中，
进行PCR扩增反应。
根据实验设计和引物特性，设置合适的PCR程
序和参数。
6. 数据分析：分析qPCR反应的数据，包括计算Ct值、绘制标
准曲线、计算目标基因的相对表达量等。
确保数据的准确性和可靠性。
7. 结果解读：根据数据分析结果，解读实验结果。
判断目标基因的表达水平、基因型等信息，为后续实验和研究提供参考。
总的来说，qPCR操作流程包括样品处理、质控检测、反转录、准备反应体系、进行PCR反应、数据分析和结果解读等步骤。
通过严格的实验设计和操作规范，可以获得准确、可靠的实验结果，为分子生物学研究提供重要的数据支持。
实时荧光定量PCR详细操作步骤流程！
实时荧光定量PCR详细操作步骤流程！原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
步骤一、样品RNA的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12 000 rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。
混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE 中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul 取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
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实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒95°C 0秒0.1°C/秒。