实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
实时荧光定量PCR原理与分析方法
实时荧光定量PCR原理与分析方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。
与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。
实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。
qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。
SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。
SYBR Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。
这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。
探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。
在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。
在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。
探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。
无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。
首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。
然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。
利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。
实时荧光定量PCR简介
实时荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有8 年了，但是其应用在近四年才迅猛增长。
在Medline 数据庫中，用“ Taqman” 或”real time PCR” 作为关键词检索，在1996 年仅有19 篇，在1997 年仅有28 篇，在98 、99 、2000 年分别达到了52 、157 、409 篇，2003 年已经达到2984 篇，相信在不久的将来会有更多的文章发表。
针对实时PCR 这一热点领域，闪晶公司对它进行了深入细致的研究，并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。
荧光定量PCR基本原理•Taqman 技术：该技术以美国ABI 公司为代表。
PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。
该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5' －3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。
•Beacon 技术：该技术以美国人Tagyi 为代表。
也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
•FRET 技术：该技术以Roche( 罗氏公司) 为代表。
它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的3 …端标记荧光激发基团，另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。
如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。
荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。
荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。
在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。
实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介
实时荧光定量 PCR 技术简介实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。
现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA探针对目标基因进行定量。
一、利用荧光染料进行定量一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链DNA 结合，并产生荧光。
游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。
利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。
然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。
二、利用荧光探针进行定量荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。
此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。
荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。
在PCR 反应过程中，引物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。
每增加一条目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。
使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。
实时荧光定量pcr原理
实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，rt-qPCR）是一种常用于新生儿筛查和诊断病原体检测的分子定量方法。
它利用荧光标记的分子生物学技术，可以快速直接对特异的核酸序列进行检测，使检测过程更加精确快速，具有更高的特异性，可以测量微量样品。
实时PCR是基于PCR（聚合酶链反应）技术，它可以连续调整DNA或RNA片段的分子复制，目的是使目标DNA或RNA片段的量变得更多。
实时荧光定量PCR与其他实时PCR技术类似，但具有独特的优势，即在各个PCR周期中，它不仅可以检测和计数特定的DNA或RNA片段，而且可以定量检测，其特异性高强烈。
实时荧光定量PCR的工作原理是将一种可燃的标记的荧光物质（如恩替卡韦）收集到一起，成为荧光标记物或标记基因。
在性能上，它是一种热力学分子生物学技术，可以直接对特异的核酸序列进行检测。
当溶液中的特定核酸序列（如基因型）与检测溶液中的匹配（比如，使用收集器）时，荧光探针的特定的荧光单片将被激活，以及一系列的共同发光反应，从而产生荧光终级产物（FIP）。
最终，FIP的强度可以确定检测溶液中特定的基因的数量，用于定量。
实时荧光定量PCR的优势有：（1）高灵敏度。
它可以检测出非常小的核酸序列，即使它们微乎其微，甚至只有几个DNA底片；（2）快速。
可以在几个小时内完成；（3）高选择性。
它只是仅仅检测和计数特定的基因序列；（4）高特异性。
实时荧光定量PCR可以检测出比单次PCR更多的核酸片段，因此更加精确可靠；（5）高绝对量数据。
它可以提供准确的检测结果，并可以用于直接比较不同标本的数量差异；（6）同时测量多个基因。
可以特异性地检测不同家族的基因，即使这些基因的序列和尺寸都存在很大的差异，也可以很容易的检测到它们。
实时荧光定量PCR的主要应用是在基因组学及病毒学研究中，如检测HIV抗原、癌症基因组遗传学分析、突变定位以及新生儿疾病筛查等。
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实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。
如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。
因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。
二．荧光定量PCR的2类方法（按荧光产生的原理分类）染料法（SYBR Green法）染料法即利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。
该方法与常规的PCR 类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。
该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。
与EB的性能类似，SYBR Green也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBR Green能特异性的与之结合并在497nm激发下。
染料法的优点：1，无需设计、合成探针，实验成本低；2，使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。
染料法的缺点：1，由于SYBR Green与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。
因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增；2，由于SYBR Green的上述特点，该方法不能应用于Multiplex QPCR技术。
（在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况）探针法（以TaqMan探针为例）探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于：在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。
目前市场上的探针主要种类有：TaqMan、Molecular Beacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最广泛。
TaqMan探针的结构：长度与普通PCR引物类似，大约20bp左右。
在5’与3’端各标记有一个荧光基团，5’的荧光基团称为报告基团（Report），3’的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。
TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特定波长的荧光信号。
TaqMan探针法工作原理：变性（95°C）：模板dsDNA充分解链；复性、延伸、酶切降解（60°C）：1，探针与靶序列结合；上、下游引物与靶序列结合；3，上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5’→3’聚合功能）；4，当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥5’→3’外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；荧光信号的检测：由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。
与染料法相比TaqMan探针法的优点：1，实验的特异性得到了提高；2，对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行Multiplex QPCR。
与染料法相比TaqMan探针法的缺点：1，探针的使用提高了实验成本；2，探针的使用需要设计及优化。
三．确定样品起始模板拷贝数的2类方法绝对定量采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数的样品）建立标准曲线，建立Ct 值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。
标准品的种类：含目的基因的质粒（经酶切线性化处理，其中的插入片段必须采用与QPCR 实验中相同的引物扩增得到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品使用较为广泛。
标准品的定量：UV A260、荧光分光光度检测等。
为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进行归一化的处理：1，对各样品进行细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后得到的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。
相对定量与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。
就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。
某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下：公式说明：Rel.Quantity：目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；GOI：目的基因（Gene of Interest）；Norm：内参基因（Reference Gene，Normalizer，House Keeping Gene）Eff：PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率；使用该公式时，需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2-ΔΔCt。
为什么需要设立内参基因？如果仅仅比较目的基因的ΔCt是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响：1，样品处理时不同的纯化得率；2，RT-PCR过程中不同的逆转录效率；3，QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。
由于上述3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上，因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理，使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，这样得出的结果才具有可信性与良好的重复性。
（注意：内参基因的（1+EffΔCt）位于分母的位置，进行除法的运算。
）如何选择内参基因？符合什么标准的基因可以作为内参基因？由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必须满足以下3个条件：1，在不同的细胞、组织中具有恒定的表达；2，在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；3，在不同的实验状态下具有恒定的表达。
内参基因的ΔCt一般小于2（即小于1倍的表达差异），一般采用的内参基因都是一些管家基因，使用最多的为：ß-actin、GAPDH、18sRNA等。
需要注意的是：并非传统意义上的管家基因都能作为内参基因，还是需要与具体的实验结合起来综合考虑。
例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达，不能作为内参基因。
因此在选择内参基因时建议：1，查阅相关文献；2，设立多个内参基因；3，采用表达谱的方法确定理想的内参基因。
采用Singleplex还是Multiplex？可以采用Singleplex的方法在不同的反应管内得到同一样品目的基因与内参基因的Ct 值，再利用上述公式进行计算。
在这种情况下可以使用SYBR Green法进行实验。
也可采用Multiplex的方法在一个反应管内得到同一样品目的基因与内参基因的Ct值，再利用上述公式进行计算。
采用TaqMan探针法（目的基因与内参基因的探针进行不同的荧光标记）可以采用Multiplex的方法。
Multiplex对于Singleplex的优点：1，节约了样品的使用量，尤其是针对样品比较珍贵的情况；2，可以加快实验的速度，节约实验成本；3，避免了Singleplex的误差，因为目的基因与内参基因是在不同的反应管内得到的。
四．引物与探针的设计QPCR引物设计与常规PCR引物设计的原则基本相同，需特别注意的就是为了尽可能使PCR扩增的效率达到100%，因此QPCR扩增产物的片段长度一般小于400bp，在设计引物的时候尽可能将产物长度控制的短些。
引物与探针设计的要求：1，高PCR扩增效率，接近100%；2，高特异性，扩增过程中没有非特异性产物；3，实验的重复性，相关系数接近1。
SYBR Green法（引物设计基本原则）PCR扩增产物长度范围100~400bp，扩增片段中避免出现强烈的二级结构；引物的GC含量为30~80%，最佳范围50~60%；引物的Tm值范围为62~67°C，上、下游引物的ΔTm小于2°C；引物序列中避免出现连续4个相同的碱基；避免引物本身或引物间形成二级结构，在引物3’端最后5个碱基中避免出现2个以上的G或C；引物最好设计在不同Exon的区域，其间含有一些比较大的Intron；利用BLAST或其他引物设计软件（如Beacon Designer）对引物的特异性进行检查。