实时荧光定量PCR全方位解析
实时荧光定量PCR原理与分析方法
实时荧光定量PCR原理与分析方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。
与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。
实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。
qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。
SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。
SYBR Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。
这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。
探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。
在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。
在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。
探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。
无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。
首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。
然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。
利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括 高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护 ，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验 的重复性和准确性，包括调整模板浓 度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以 找到最佳的反应条件，使扩增曲线更 符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备 、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问 题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因 的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等 问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从 而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、 循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂， 并进行预实验以确定最佳的反应条件。
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)完全手册
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
实时荧光定量pcr的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用1. 简介实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种强大的分子生物学技术，能够在同一反应体系中完成DNA扩增和定量，具有高灵敏度、高特异性和高精确性的优势。
本文将介绍实时荧光定量PCR 的原理和应用。
2. 原理实时荧光定量PCR基于传统PCR技术的基础上，引入荧光染料或探针来实时监测PCR反应过程中产生的增量扩增DNA量。
其原理如下：1.DNA模板的变性：通过加热将DNA模板的双链DNA变性成两个单链。
2.引物结合：待扩增的特定DNA序列的引物（Forward primer和Reverse primer）与模板DNA的互补序列结合。
3.DNA聚合酶扩增：DNA聚合酶沿着模板DNA链酶解附近的单链DNA，并将新的DNA链合成。
4.荧光信号监测：引入特定的荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针），实时监测PCR反应体系中DNA扩增量的变化。
5.数据分析：使用特定的PCR仪器记录和分析荧光信号，根据荧光信号的变化量确定目标DNA序列的起始量。
3. 应用实时荧光定量PCR技术在许多领域中有广泛的应用，主要包括以下方面：3.1 疾病诊断与检测实时荧光定量PCR可以用于快速检测和诊断各种疾病，例如：•新型冠状病毒（COVID-19）检测•癌症标志物的检测•细菌和病毒感染的检测•遗传性疾病的检测3.2 基因表达分析实时荧光定量PCR可以用于研究基因的表达水平，包括：•基因表达差异分析•基因调控网络的研究•基因表达谱的分析•转录因子的研究3.3 环境监测实时荧光定量PCR可以应用于环境监测领域，用于检测和量化环境中的微生物和污染物，例如：•水质监测中细菌和病毒的检测•土壤中污染物降解菌的鉴定和定量•空气中微生物的检测3.4 遗传学研究实时荧光定量PCR在遗传学研究中也有广泛的应用，包括：•DNA定量和质量检测•突变检测和鉴定•群体遗传学分析•基因组学研究4. 总结实时荧光定量PCR技术是一种准确、高效、灵敏的分子生物学技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学和农业等领域。
一文看懂：荧光定量PCR的原理、方法及结果分析
⼀⽂看懂：荧光定量PCR的原理、⽅法及结果分析⾃从1983年K. Mullis发明聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。
⽽实时荧光定量PCR技术，顾名思义，就是在PCR的基础上加⼊荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，最后通过对未知模板进⾏定量分析的⽅法。
⽬前，实时荧光定量 PCR 已成为不同样品间进⾏基因表达⽔平定量差异⽐较的权威性⽅法。
在过去⼗⼏年中，该⽅法迅速流⾏，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、⼯业和医学研究。
实时荧光定量PCR的应⽤⽬前，qPCR技术已经⼴泛应⽤于⽣物医药⾷品等⾏业，应⽤于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、⾷品病原微⽣物的检测、转基因⾷品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括：●基因扩增●扩增特异性分析●基因定量分析●基因检测●基因分型● SNP分析● RFLP多态性分析●单/多基因表达研究●⾼通量基因表达谱研究……实时荧光定量PCR的常⽤⽅法 染料法荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺⼊双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。
同时，其缺点也在于其⾮特异性。
当PCR反应中有引物⼆聚体或者⾮特异性扩增时，该染料也可以和这些⾮特异性扩增产物结合，发出荧光，从⽽⼲扰对特异性产物的准确定量。
常⽤的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作⽤等进⾏改进，也推出了很多新的染料供⼤家选择。
Promega采⽤新型荧光染料BRYT Green® Dye，对qPCR反应没有抑制作⽤，与双链DNA结合后荧光信号更强.探针法在PCR扩增时加⼊⼀对引物的同时加⼊⼀个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸：5’端标记⼀个报告荧光基团，3’端标记⼀个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号。
实时荧光定量PCR全方位解析
实时荧光定量PCR全方位解析实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
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实时荧光定量PCR全方位解析实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
操作过程一、样品RNA的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12 000 rpm 离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数×40 μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀释至495 μl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定（1）制胶1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10×MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4 M MOPS，pH 7.00.1 M 乙酸钠0.01 M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。
胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。
5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cDNA合成1. 反应体系序号反应物剂量1 逆转录buffer2 μl2 上游引物0.2 μl3 下游引物0.2 μl4 dNTP 0.1 μl5 逆转录酶MMLV 0.5 μl6 DEPC水 5 μl7 RNA模版 2 μl8 总体积10 μl轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。
3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR1. β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl 按10倍稀释（加水27 μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
2. 反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10 μl2 阳性模板上游引物F 0.5 μl3 阳性模板下游引物R 0.5 μl4 dNTP 0.5 μl5 Taq酶 1 μl6 阳性模板DNA 5 μl7 ddH2O 32.5 μl8 总体积50 μl轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
3. 管家基因反应体系：序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10 μl2 内参照上游引物F 0.5 μl3 内参照下游引物R 0.5 μl4 dNTP 0.5 μl5 Taq酶 1 μl6 待测样品cDNA 5 μl7 ddH2O 32.5 μl8 总体积50 μl轻弹管底将溶液混合，6000 rpm短暂离心。
3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。
五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
2. 反应体系序号反应物剂量1 10×PCR缓冲液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上游引物F 0.5 ul4 下游引物R 0.5 ul5 dNTP混合液 3 ul6 Taq聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为25 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72?C延伸5分钟。
（3）PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。
（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、待测样品的待测基因实时定量PCR1. 所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
2. 体系配置如下：序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10 ul2 上游引物 1 ul3 下游引物 1 ul4 dNTP 1 ul5 Taq聚合酶 2 ul6 待测样品cDNA 5 ul7 ddH2O 30 ul8 总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。
反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
七、实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
八、电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。
PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
注意事项防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。