实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤
荧光定量PCR仪操作流程资料
荧光定量PCR仪操作流程1、开启电脑，并打开Smart Cycler开关,启动Smart软件，系统用户名为Smart，密码为Cycler。
若Create Run 图标非灰色，表明机器已与电脑连接，否则应重新连接，直至Create Run 图标变亮。
2、定义一个程序⑴. 点击Define Protocols 图标。
⑵. 点击New Protocols 图标。
⑶. 输入一个独特的程序名。
⑷. 输入热循环参数。
⑸.点击Save Protocol按钮。
3、创建运行⑴. 点击Create Run 图标。
⑵. 输入一个Run Name。
⑶. 选择Dye Set。
⑷. 点击Add/Remove Site按钮⑷a. 突出一个程序名。
⑷b. 突出位点。
⑷c.点击右箭头。
⑷d.重复⑷a-⑷c步骤直到所有程序和点都被选定。
⑸.点击OK。
⑹.点击Start Run按钮。
4、实时监控反应过程（这一步可省）5、实验完毕，分析实验结果运行开始后，程序会自动切换到View Results栏。
在运行过程中，用户能实时监控温度和光学数据，选择图表，分析设置和样品类型信息。
在运行完成前后及运行期间，分析设置、图表和样品类型信息可以改变。
运行过程中，可以查看存在电脑中的以前的运行。
6、保存并输出实验数据⑴点击View Results显示栏的Export按钮。
⑵检查输出数据类型。
⑶点击Export Data根目录里的Export按钮。
⑷从Look In下拉菜单里选择一个文件夹。
程序默认为Smart Cycler文件夹里的Export文件夹。
⑸.输入一个文件名或接受一个默认的文件名，点击Save。
生物技术中心仪器管理人：李红兵2006年10月15日。
荧光定量仪操作指南
荧光定量仪操作指南1.准备工作在使用荧光定量仪之前，需要进行一些准备工作：-打开仪器电源，并接通仪器的电源线。
-启动仪器，并等待其自检完成。
-检查仪器所需的配件是否齐全，如荧光管、滤光片等。
2.校准仪器在进行荧光定量测量之前，需要对仪器进行校准，以确保测量结果的准确性。
校准通常包括两个步骤：-波长校准：使用标准荧光溶液，根据其发射波长设置仪器的激发和发射波长。
-亮度校准：使用标准荧光溶液，根据其知名的荧光强度设置仪器的亮度。
3.准备样品在测量样品之前，需要进行一些准备工作：-根据测定要求，选择合适的荧光染料，并将其溶解在适当的溶剂中。
-在样品舱中选择合适的载体，如荧光底板或石英反射板，并将样品涂覆在载体上。
4.进行测量在开始测量之前，需要进行一些操作：-打开样品舱盖，并将载体放置在样品舱中。
-选择适当的激发波长和发射波长，并将它们设置到仪器上。
-调节仪器上的曝光时间，以确保荧光强度在仪器的线性范围内。
5.数据分析测量完成后，需要对数据进行分析：-使用仪器上的软件导出数据，并存储到计算机中。
-对数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。
-通过比较样品间的荧光强度，得出相应的结论。
6.清洁和维护在使用荧光定量仪完成实验后，需要进行仪器的清洁和维护工作：-关闭仪器电源，并拔下电源线。
-将使用过的载体和滤光片取下，并进行清洗。
-清洁仪器的外壳和光学系统，可以使用干净的纸巾或专门的清洁剂。
注意事项：-避免直接接触荧光管，以免对其造成损坏。
-在测量荧光强度之前，应先调节仪器的对比度和亮度，以获得清晰的图像。
-在测量过程中，尽量避免光线干扰，可在实验室内提供充足的遮光条件。
总结：以上是荧光定量仪的操作指南。
正确操作荧光定量仪是确保实验结果准确的重要步骤，希望本文对您在实验中使用荧光定量仪时有所帮助。
实时荧光定量PCR仪操作规程
实时荧光定量PCR仪操作规程1. 开始运行仪器打开电脑；打开定量PCR仪底座开关；启动CFX Manager软件。
2. 放置样品将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好。
注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。
将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。
3. 设置程序，运行实验定量PCR软件操作基本步骤为：a. 设置热循环程序文件（Protocol Tab）；b.设置反应板文件（Plate Tab）；c.点击“Start Run”键，运行程序；热循环程序文件（Protocol Tab）设置指南：点击Edit（编辑）或 Create New（创建新程序）；反应板设置文件（Plate Tab）设置指南：选择本次实验所要使用的荧光染料种类；单击样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“Dilution Series”键可设置其标准品浓度及稀释倍数；点击“Start Run”键。
单击open lid（打开热盖）或Close lid（关闭热盖）放置样品；单击Start Run，保存文件，开始运行程序。
4. 结果分析PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和Ct值等。
如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。
点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单。
5. 关闭运行仪器实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。
注意事项：CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。
荧光定量PCR仪使用方法
荧光定量PCR仪使用方法
（1）开机：荧光定量PCR仪、与之相连的电脑
（2）放样：点击PCR仪上的“Eject”，放入已离心过的八连管样品，再缓慢关闭接样台。
（3）点击电脑上的“E盘”，找到“qRT-PCR“文件夹，找到相对应的应用程序，如做蓝耳，就选择”PRRSV”文件夹中的程序；腹泻则为“PEDV”.
（4）编辑：点开任一程序后，点击“Sample Editor“编辑所放样品的地址以及信息。
（5）存档：点击“File“选择”Saveas“，存到相对应的文件夹；务必修改名称（日期、时间）。
（6）传出：打开编辑好的程序，点击“T ool”→“Instrument Manager”，待灯变绿后（5-7s），再点击“Send/Receive Experiment”，找到要运行的程序，再点击＞，便传到荧光定量PCR仪上。
（7）运行：选中荧光定量PCR仪上要工作的程序，点击“Start”开始工作。
（8）传入：待PCR结束后，打开运行程序，点击“T ool”→“Instrument Manager”，待灯变绿后（5-7s），再点击“Send/Receive Experiment”，选中相对应的文件夹，找到已结束程序，再点击＜，便传到电脑上。
（9）实验结果分析：点击已保存已完成的程序，点击“Analysis”，便可进行实验结果的分析。
（10）关机：点击PCR仪上“Eject”，取出八连管；点“Exit”→”YES’退出，关闭电源，拔下插头即可。
另用专用塑料袋套上，以免灰尘侵入缩短使用寿命。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
PCR仪的使用步骤及原理
PCR仪的使用步骤及原理引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在分子生物学研究中广泛应用的技术。
PCR仪作为PCR操作的关键工具，能够快速无误地扩增目标DNA 序列，为科学研究和临床诊断提供了重要的支持。
本文将介绍PCR仪的使用步骤及原理。
PCR仪的使用步骤以下是PCR仪的使用步骤：步骤一：准备反应体系1.准备PCR反应液，包括DNA模板、引物、核酸酶、缓冲液等。
2.将反应液分配到PCR试管中，确保每个试管的反应体系一致。
3.在一个试管中加入水作为空白对照。
步骤二：设置PCR仪的程序1.打开PCR仪，确保仪器处于正常工作状态。
2.设置PCR仪的反应程序，包括温度、时间等参数。
根据不同的PCR实验设计，设置合适的程序。
步骤三：装载样品1.将准备好的PCR试管放置在PCR仪的样品架上。
2.检查样品架是否放置正确，确保试管紧密接触PCR仪的加热块。
步骤四：运行PCR程序1.关闭PCR仪的盖子，启动程序运行。
2.PCR仪将根据设定的程序依次进行加热、变性、退火和延伸等反应步骤。
3.在PCR反应结束后，PCR仪会保持在设定温度，以保持PCR产物的稳定。
步骤五：PCR产物分析1.关闭PCR仪的电源，打开PCR试管。
2.可通过凝胶电泳、PCR产物可视化试剂等方法对PCR产物进行分析。
3.根据实验需求，进一步处理PCR产物。
PCR仪的原理PCR仪采用了温度循环技术，利用特定的酶（聚合酶）和核酸引物来引导DNA链的复制。
其原理主要包括以下三个步骤：1.变性（Denaturation）：通过升高温度（通常为95℃），使DNA双链分离成两条单链DNA。
2.引物结合（Annealing）：降低温度（通常为55-60℃），使引物与目标序列的单链DNA互补结合。
3.延伸（Extension）：增加温度（通常为72℃），使聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
通过不断重复这三个步骤，PCR仪可以在短时间内扩增特定的DNA序列。
实时荧光定量PCR详细操作步骤流程！
实时荧光定量PCR详细操作步骤流程！原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
步骤一、样品RNA的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12 000 rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。
混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE 中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul 取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
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实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤
——以RNase P示例实验为例
一、定义384孔样品模块的实验属性
打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。
单击Experiment Setup图标。
单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。
在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入：
二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。
1. 单击Define以访问Define屏幕。
2. 定义目标基因
a. 单击New以增加和定义目标基因。
b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入：
c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。
d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。
3. 定义样品
a. 单击New以增加和命名样品。
b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入：
c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。
d. 单击Add Saved从样品库添加样品。
4. （可选）定义生物学平行测定
a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行
测定组。
b. 从下拉菜单选择Color。
c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。
注：实验示例不使用生物学平行测定组。
保留Biological Replicate Groups空白。
5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
三、分配目标基因、样品和生物学组
利用Assign（分配）屏幕将目标基因、样品和生物学平行测定组分配到RNase P实验示例反应板内的各孔。
注：您可以在不进行分配的情况下开始运行，但在扩增曲线中，将不会有实时数据（只有在您已经对板进行设置后，才可以见到扩增曲线）。
1. 单击Assign以访问Assign屏幕。
2. 定义并设置标准品。
a. 单击Assign屏幕上的Define and Set Up Standards（定义和设置标准品）。
b. 选择目标基因。
c. 定义标准曲线。
d. 为标准品选择和安排反应孔。
3. 目标基因和样品。
a. 利用Assign屏幕上的板布局或反应孔表选择反应孔。
b. 利用下拉菜单分配目标基因RNase P为其任务。
c. 选择您想要分配给所选反应孔的样品附近的复选框。
四、设置运行方法
利用Run Method屏幕为RNase P实验设置运行方法。
1. 单击Run Method以访问Run Method屏幕。
2. 为每个孔的反应体积输入1到20的数字。
对于下列消耗品，ViiA™ 7仪器支持的最
大反应体积如下：
① MicroAmp® Optical 384孔反应板–20μL
②微流体卡–1μL
3. 在Graphical View选项卡中：
①确保热循环扩增曲线适合您的试剂。
②如需要，可对默认的运行方法进行编辑，或用ViiA™ 7 Dx软件随附的运行方法
库中的一个运行方法代替默认运行方法。
③通过单击启用数据采集。
注：当需要对各阶段实时采集的数据进行分析时，启用数据采集特别有用。
④编辑升降温速度。
您可以增加或降低某一阶段的升降温速度。
⑤编辑PCR阶段
a. 更改PCR阶段的循环次数。
b. 选择Enable AutoDelta复选框以增加或降低后续各循环的温度和（或）保温
时间。
您还可以更改AutoDelta的起始循环。
启用AutoDelta后会显示图标。
单击AutoDelta Off图标以改变AutoDelta Settings对话框中循环阶段的
AutoDelta设置。
然后，单击Save Setting以显示AutoDelta On 图标。
五、开始实验
1. 触碰ViiA™ 7 Dx Instrument仪器触屏上的按钮，或单击ViiA 7软件
Instrument Console屏幕的Open Door，以从仪器侧面弹出板适配器。
2. 将反应板或微流体卡放到板适配器上。
确保反应板或微流体卡正确对齐。
①确保孔A1位于反应板或微流体卡托盘左上方的位置。
②确保反应板或微流体卡的条形码朝向仪器的前面。
3. 触碰ViiA™ 7 Dx Instrument仪器触屏上的按钮，或单击ViiA™ 7软件
Instrument Console屏幕的Close Door，以将板适配器收回。
六、运行实验
1. 在ViiA™ 7 软件中，单击导航窗格中的Run（运行）。
2. 单击START RUN开始运行实验。