实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR
SYBR Green法优缺点
优点 缺点
容易与非特异性双链DNA结 对DNA模板没有选择 合，产生假阳性但可以通过 融解曲线的分析，优化反应 性--适用于任何DNA 条件 使用方便--不必设计复 对引物特异性要求较高 杂探针 非常灵敏 便宜
TaqMan法
•
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的 序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引 物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而 淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时， 荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。 但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进 行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有 售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断 积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
• • • •
SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 在延伸结束阶段采集荧光信号。 SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所 以必须在反应结束时做熔解曲线分析。
SYBR Green 熔解曲线分析
PCR反应体系的建立及优化
• SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，
目前，实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于 基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发 等领域。 其中最主要的应用集中在以下几个方面：
1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。 包括 病原微生物或病毒含量的检测、 转基因动植物转基因拷贝数的检测、 RNAi 基因失活率的检测等。
实时荧光定量PCR技术的操作实践
实时荧光定量PCR技术的操作实践实时荧光定量PCR技术是一种在生物医学领域应用广泛的分子生物学技术，主要用于基因表达水平的研究、疾病诊断和生物制品定量等。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术的实验原理、操作实践、结果分析和总结。
实时荧光定量PCR技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累与PCR产物形成正比的关系，从而实现对目标基因的定量分析。
实验过程中，荧光信号被实时检测并记录，通过荧光阈值设定，将荧光信号转换为数量，最终实现对目标基因的定量分析。
准备实验材料和设备：包括RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR仪、PCR引物、荧光染料等。
提取RNA：将组织或细胞中的总RNA提取出来，根据需要逆转录成cDNA。
实时荧光定量PCR：将cDNA、荧光染料和特异性引物混合，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。
数据收集和分析：收集荧光信号数据，根据标准曲线计算目标基因的相对表达量。
RNA提取时需选择合适的试剂，根据组织或细胞类型进行优化。
实时荧光定量PCR反应条件需根据目标基因和仪器型号进行调整，以确保最佳扩增效果。
荧光染料的加入要适量，以避免对PCR产物产生影响。
标准曲线的制作要采用已知浓度的样品，以便计算未知样品的相对表达量。
实验数据分析和解读是实时荧光定量PCR技术的关键环节之一。
通过对荧光信号数据的收集和分析，可以获得目标基因的表达量。
在标准曲线上，可以根据已知样品的浓度计算未知样品的相对表达量。
通过比较不同样品中目标基因的表达量，可以研究基因表达水平的差异。
还可以利用相对定量和绝对定量两种方法对目标基因进行定量分析。
在本次实时荧光定量PCR实验中，我们成功地检测了目标基因的表达量，并对其进行了相对定量和绝对定量的分析。
通过比较已知样品和未知样品的数据，我们发现目标基因的表达量在未知样品中明显高于已知样品。
这一结果表明，目标基因在未知样品中的表达水平较高，可能与某种特定条件或因素相关。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
• n：扩增反应的循环次数
• X：第n次循环后的产物量
• X0：初始模板量 • Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
在扩增产物达到阈值线时:
设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数
利用TaqMan法
数据分析
检测血液中的HBV
分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105
TaqMan法
应用范围
起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
4、Amplisensor
R
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
SYBR Green
SYBR Green 法
工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
Flourescenc
定量原理
Ck 102
Sample
Ck 104
Cycle number
Cycle number
Log of DNA concentration
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
荧光定量pcr实验小结
荧光定量pcr实验小结荧光定量 PCR 实验小结荧光定量 PCR（Quantitative Realtime PCR，qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，用于定量检测特定核酸序列的含量。
在经历了多次荧光定量 PCR 实验后，我积累了不少经验，也遇到了一些问题，在此进行一个小结。
一、实验原理荧光定量 PCR 的基本原理是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
在 PCR 反应过程中，随着产物的增加，荧光信号也会相应增强。
通过检测荧光信号的变化，可以确定 PCR 反应的起始拷贝数。
二、实验准备1、试剂和耗材选择高质量的 PCR 引物和探针，确保其特异性和有效性。
准备合适的 PCR 反应缓冲液、dNTPs、Taq 酶等试剂。
使用无菌、无核酸酶污染的离心管、移液器吸头和 PCR 板。
2、样本制备提取高质量的核酸样本，如 DNA 或 RNA，并确保其纯度和完整性。
对 RNA 样本进行反转录，得到 cDNA 用于后续的 PCR 反应。
3、仪器设备荧光定量 PCR 仪，需要提前进行校准和维护，确保其性能稳定。
三、实验步骤1、反应体系配制根据实验要求，计算并配制合适体积的 PCR 反应体系。
将各组分依次加入离心管中，充分混匀，避免产生气泡。
2、加样使用移液器将反应体系准确地加入到 PCR 板的各个孔中。
加入待测样本和标准品，注意更换移液器吸头，防止交叉污染。
3、上机运行将 PCR 板放入荧光定量 PCR 仪中，设置好反应程序和参数。
启动仪器，开始进行 PCR 反应，并实时监测荧光信号。
四、实验中的关键环节1、引物和探针设计引物和探针的设计直接影响实验的特异性和灵敏度。
要选择合适的序列，避免引物二聚体和非特异性扩增。
可以使用在线设计工具，并结合相关文献进行优化。
2、反应条件优化退火温度是影响 PCR 反应特异性的重要因素，需要通过梯度 PCR进行优化。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括 高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护 ，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验 的重复性和准确性，包括调整模板浓 度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以 找到最佳的反应条件，使扩增曲线更 符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备 、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问 题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因 的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等 问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从 而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、 循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂， 并进行预实验以确定最佳的反应条件。
实时荧光PCR简介及结果分析
效率越高 3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。 4、各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效
率相近。
实验中样品浓度所遇到问题
原因：样品浓度跨度太大
解决方案：上图显示的样品浓度跨度太大导致信号值显示差异大，我们可以重 新将样品的稀释多个梯度后再进行相关实验验证
实时荧光PCR简介 及检测结果分析
疾控中心检验科
主要内容
1
实时荧光PCR技术基础理论
2
实时荧光PCR结果分析
3
PCR异常曲线解析
一、实时荧光PCR技术基础理论
1、实时荧光PCR技术概论 实时荧光PCR技术产生并成熟于上世纪90年
代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞 跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控， 并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在 短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了 广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的 一项重要技术。
设定三原则： 指数扩增初期、 整体曲线倾斜程度一致、 高于阴性对照的地方
实验结果的总体分析方法：
整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂 污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的异常 曲线情况；
阴性对照分析：观察是否存在污染； 阳性对照分析：观察是否在质控范围内。
判断扩增曲线是否良好的指标： 1、曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而
左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指 数期很短-线性图；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关 系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点-对数图。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR），也称为荧光定量PCR，是一种常用于检测和定量DNA或RNA的分子生物学技术。
相比传统的PCR方法，实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度、准确性和特异性，能够量化目标核酸序列的含量。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应的进行和荧光信号的检测与实时监测。
PCR反应是通过逐渐升高的温度循环，使DNA链解链、引物与模板相互结合，合成新的DNA链，不断扩增目标序列的过程。
荧光信号的检测是通过加入特定的荧光探针，在PCR反应过程中的每个循环都量化目标序列的含量，并以荧光信号的强度来表示。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的方法及其一般步骤。
1. 样品处理与提取：首先需要从待测样品中提取出目标DNA或RNA的模板，并进行适当的处理。
比如，可以使用细胞裂解液或提取试剂盒来裂解和纯化细胞或组织中的核酸。
2. 反转录：对于需要检测的RNA目标，需要先将其反转录为cDNA。
这一步骤通常使用反转录酶和适当的引物，在一定的温度条件下合成cDNA。
反转录反应通常在37-42C进行。
3. 扩增反应体系制备：根据实验需要和反应装置的规格，配制好PCR反应的体系。
体系中的成分通常包括模板DNA（cDNA或DNA模板）、引物（前向引物和逆向引物）、荧光标记探针（如TaqMan探针）、聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTPs等。
4. PCR扩增条件设置：根据模板DNA的长度和序列特性，设置PCR反应的温度和时间条件。
通常，PCR反应的温度包括初始变性（95C）、扩增（56-72C）和延伸（72C）等多个循环。
5. 荧光信号的检测与实时监测：PCR反应过程中，可以通过专用的实时荧光定量PCR仪器进行检测和监测。
这类仪器常常能够实时记录PCR反应的荧光信号强度，并产生实时的反应曲线图。
根据荧光信号的强度变化，可以推断目标DNA 或RNA的含量。
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目录 • 实时定量PCR基本原理
• 实时定量PCR实验材料
• 实时定量PCR实验方法
• 实时定量PCR实验结果
实时定量PCR基本原理
1 实时定量PCR的定义 2 实时定量PCR标准曲线
实时定量PCR的定义 • 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精 确的对起始模板的定量分析
整理方程式得:
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
实时定量PCR标准曲线
• 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
106 105
104
103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
定量原理
• 浓度的对数值与循环数呈 线性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数（Ct值） 就可分析样品中起始模板 量定量PCR的实验步骤来自1 标准菌株DNA的提取
2 3 4 5 6 7 QPCR探针和引物的设计 阳性克隆质粒的构建 荧光定量PCR反应 定量标准曲线 重复性实验 灵敏性实验
定量PCR三个基本概念
• 扩增曲线
平台期 背景期 指数增 长期 线性增长期
阈值与C(t)值
• 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍，设定在扩增曲线指数增长期 • C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增 循环次数
C(t) value
Threshold line
18.12 +/- 0.04
C(t) value
定量PCR的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n • 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
实验材料