荧光定量PCR实验步骤
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
荧光定量pcr步骤
荧光定量pcr步骤荧光定量PCR(real-timePCR)一种高通量的核酸定量分析技术，用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量。
荧光定量PCR是基于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时PCR技术，结合这两种技术，可以非常快速地检测和定量基因表达。
本文将介绍荧光定量PCR的步骤。
第一步：样品的准备与检测1.1品的准备：首先，细菌或病毒样品根据实验要求进行灭菌或病毒灭活。
1.2测：根据需要，采用适当的抗体检测样品中是否有病毒和细菌，将病毒和细菌样品中的RNA或DNA分离出来，将分离出来的核酸用于下一步检测。
第二步：荧光定量PCR反应2.1品添加：将分离出来的核酸和所需的实验试剂（如反转录酶、DNA聚合酶、定量PCR探针、模板DNA，以及相关配套试剂）混合，反应体系得到。
2.2动PCR反应：将反应体系定温热处理，使反转录酶向模板DNA 中的特定序列引物亲和，以实现反转录。
2.3入PCR探针：将定量PCR探针加入反应液中，以实现基因表达荧光定量PCR。
2.4复PCR循环：每次循环引入一定量的反应物，以实现基因表达荧光定量PCR，并在每次循环时观察荧光信号，从而实现基因表达定量。
第三步：数据分析3.1据分析：对荧光信号数据进行定量分析，实现基因表达定量，并将结果画在实验曲线上，以观察基因表达的变化情况。
3.2验结果：在实验曲线上，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为基因表达量，可以观察实验结果，以确定基因表达量的情况。
荧光定量PCR步骤是用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量的有效技术，它包括样品的准备和检测、荧光定量PCR反应、数据分析三个步骤，可以快速准确地定量检测基因表达情况，为实验中的细菌和病毒基因分析领域提供有效的参考依据。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
荧光定量PCR实验使用方法
第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、灵敏、特异性强的PCR技术，可以用于检测和定量DNA或RNA。
在qPCR中，荧光信号与PCR 产物的数量成正比，因此可以通过荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
qPCR有两种常见的方法：两步法和三步法。
两步法是最常用的qPCR方法之一。
在两步法中，反应分为两个步骤：第一步是反转录，将RNA转录成cDNA；第二步是PCR扩增，使用荧光探针或SYBR Green等荧光染料来检测PCR产物。
两步法的优点是简单易行，适用于大多数qPCR应用。
但是，两步法需要使用反转录酶来合成cDNA，这可能会引入反转录酶的偏差和不确定性。
三步法是另一种qPCR方法，它将反应分为三个步骤：第一步是反转录，将RNA转录成cDNA；第二步是前置扩增，使用特定的引物对目标序列进行前置扩增；第三步是PCR扩增，使用荧光探针或SYBR Green等荧光染料来检测PCR产物。
三步法的优点是可以减少反转录酶的偏差和不确定性，提高PCR的特异性和灵敏度。
但是，三步法需要进行前置扩增，增加了实验的复杂性和成本。
无论是两步法还是三步法，qPCR都是一种非常有用的技术，可以用于检测和定量DNA或RNA。
qPCR在医学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用，例如检测病原体、基因表达分析、环境污染监测等。
随着技术的不断发展，qPCR将会在更多的领域得到应用，
并为科学研究和临床诊断提供更加精确和可靠的数据。
荧光定量pcr三步法程序
荧光定量PCR三步法, 实现高效、准确检测！荧光定量PCR是一种常见并且有效的分子生物学技术，用于定量检测DNA的存在量。
荧光定量PCR三步法是一种可靠的PCR技术，可用于快速检测样品中特定目标序列的存在量，并实现精确计量。
以下是荧光定量PCR三步法的具体步骤：第一步：预处理样品在进行荧光定量PCR之前，需要先对样本进行预处理。
这通常包括提取和纯化DNA，并确定其浓度和质量。
确保样品处理后的DNA为适合荧光定量PCR的高质量DNA，防止因样品处理不当而导致PCR 偏差和假阳性或假阴性结果。
第二步：进行荧光定量PCR反应荧光定量PCR反应为三步法。
第一步，反应混合物中需包含模板DNA、两个引物和荧光探针等成分。
第二步，放入PCR扩增仪设定反应条件，启动PCR反应。
反应过程中，荧光探针随着PCR基因扩增而被切割释放，释放出的荧光信号与扩增的目标DNA数量成正比。
第三步，利用PCR荧光测量设备检测扩增产品，并测量PCR信号增加的曲线。
第三步：数据分析荧光定量PCR数据分析是一项重要的步骤，它可以确定扩增的DNA目标的数量和浓度。
根据荧光信号和PCR产物在阈值周期内的翻倍次数来确定PCR 细胞内目标DNA的存在量。
这门技术可以提供准确、灵敏和可重复的结果，可应用于各种场景，如基因检测、体外诊断、食品安全检测等等。
综上所述，荧光定量PCR三步法是一种高效且可靠的PCR技术，可用于快速检测样品中特定目标序列的存在量，并实现精确计量。
它是分子生物学研究和诊断等领域不可缺少的重要技术手段。
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2016.4.27
实时荧光定量PCR：
利用荧光信号的变化实时检测PCR反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分 析。
Ct值：PCR扩增反应中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值
时所经过的扩增循环次数。模板DNA量越多，荧光达到阈值的循 环数越少，则Ct值越小。
琼脂糖凝胶电泳：
2.实验步骤：
2.1 安装电泳槽 2.2 制备琼脂糖凝胶，称取2g琼脂糖，溶于100mL 1×TAE中，微波加热至完 全溶解。
2.3 灌胶：将的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
2.4 待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 2.5 加样。 2.6 120V稳压约20min. 2.7 观察。
常用荧光标记方法：
2. Taqman 探针法 探针两端分别标记一个报告荧光基团(R)和一个淬灭荧光基团(Q)。 PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧 光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号 ，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步。
序号
1 2
试剂名称
乙型肝炎病毒-核酸释放剂 乙型肝炎病毒-PCR反应液
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
主要成分及作用
释放样本中的核酸 引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCR buffer
3
4 5 6
乙型肝炎病毒-酶混合液
乙型肝炎病毒-内标 乙型肝炎病毒-定量参考品A 乙型肝炎病毒-定量参考品B
Taq酶、UNG酶
阳性内对照，避免PCR假阳性 定值的阳性样本，浓度：4×107IU/mL 定值的阳性样本，浓度：4×106IU/mL
2.样品处理：
2.1 每组取3个定量PCR管，每个PCR反应管中加入HBV-核酸释放剂5ul， 然后加入待测样品15ul ，阴性对照、阳性对照以及定量参考品A,B,C,D 各15ul，吸打3-5次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）； 2.2 间隔10分钟以上，每管加入PCR混合液40ul，2000rpm离心30秒。
7
8 9 10
乙型肝炎病毒-定量参考品C
乙型肝炎病毒-定量参考品D 乙型肝炎病毒-阴性对照 乙型肝炎病毒-阳性对照
定值的阳性样本，浓度：4×105IU/mL
定值的阳性样本，浓度：4×104IU/mL 阴性样本（已灭活） 定值的阳性样本（已灭活）
操作步骤：
1.试剂准备： 1.1 待测样品：取一个1.5mL的EP管，一个PCR管里需要的量：反应液 38ul+酶混合液2ul+内标0.2ul，每个样本需要做3个重复，所以吸取反应 液114ul+酶混合液6ul+内标0.6ul ，在EP管中充分混匀，即为PCR混合液 ，瞬时离心后备用。 1.2 阳性对照、阴性对照、定量参考品A,B,C,D：吸取反应液684ul+酶混 合液36ul+内标3.6ul ，在EP管中充分混匀，即为PCR混合液，瞬时离心 后备用。
琼脂糖凝胶电泳：
1.实验原理：
琼脂糖是一种固相电泳支持物，DNA在碱性条件下带负电荷，在电场中通过凝胶介 质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同 ，因此可以分离鉴定和提纯DNA片段。
胶浓度与DNA片段大小的关系：
凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp） 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0 1000-30000 800-12000 500-10000 400-7000 200-3000 50-2000
3. PCR扩增 4. 琼脂糖凝胶电泳检测
5. 结果分析
6. 质量监控 5.1 HBV阴性对照：无Ct值显示；但HBV-内标检测为阳性（Ct值≤40）。 5.1 HBV阳性对照：检测浓度值介于1.26×105-1.26×106IU/mL. 5.4 四个定量参考品（A,B,C,D）：均检测为阳性，且标准曲线相关系数 r≥0.98.
标准曲线：利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，横坐
标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值，因此只要知道未知样 品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
常用荧光标记方法：
1. SYBR Green Ⅰ SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有双链DNA螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。