实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤
荧光定量PCR的基本原理和步骤
荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA分子。
其基本原理是在PCR过程中加入荧光探针，通过监测荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
下面是荧光定量PCR的基本步骤：
1. 样品处理：首先需要从待检测样品中提取DNA或RNA，并进行适当的处理，例如反转录、扩增等。
2. 设计引物：根据待检测的目标序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系的制备：将引物、荧光探针、dNTPs、PCR缓冲液等混合，制备PCR反应体系。
4. PCR反应：将样品DNA或RNA与PCR反应体系混合，进行PCR反应。
5. 荧光定量：在PCR反应过程中，荧光探针会结合到目标序列上，并通过荧光信号的产生来检测PCR产物的数量。
在荧光定量PCR中，通常采用SYBR Green或TaqMan探针来检测PCR产物的数量。
6. 数据分析：通过对荧光信号的强度进行分析，计算出样品中目标序列的数量，并进行比较和分析。
需要注意的是，在荧光定量PCR中，需要选择合适的荧光探针和荧光信号检测系统，以确保准确和可靠的结果。
此
外，为了避免PCR过程中的污染和误差，需要严格控制PCR 反应条件和操作流程。
RT-qPCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
应用
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
非特异性产物
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化:
1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不 易检测
2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
• • • • n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
4. 反应Buffer 体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同
SYBR Green 法
起始模板的测定
基因型的分析
应用范围
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
QPCR原理及应用
实时荧光定量PCR的原理和应用，1971年qq阵列实时荧光定量PCR（PCR）的原理，Khorana提出可以在DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA引物延伸后克隆tRNA基因。
聚合酶，并重复此过程。
1985年，Mullis等人。
PE Cetus公司在美国发明了聚合酶链反应（PCR）。
PCR的基本原理是在体外模拟DNA在细胞中的复制，最初使用的是大肠杆菌。
由于该酶不耐热，因此该过程耗时，费力且容易出错。
耐热DNA聚合酶的应用使PCR效率更高。
随后，PE Cetus公司于1989年推出了第一台自动PCR热循环仪，即聚合酶链反应（PCR），被美国科学杂志评为十多项重大科学发明中的第一部，1989年是PCR 爆发的一年。
Mullis于1993年获得了诺贝尔化学奖。
Pcratcggatagcgatcgacctagc5'3'tagcgtatcgatcgacgctggatcg3'5'DNA展开链结合引物亚链延长pcratgcgatgcgtagctgacctagc5'3'tagcgtccgcccctggatcg3g3'5链延伸ggaucg5'aucgcg5'taggctatcgcacgct3'atacggtagctgacctagc3'DNA聚合酶522557294时间（min）温度（℃）合适的温度延伸3高温变性1低温退火2重复1〜3步25〜30轮靶DNA片段扩增超过1百万次DNA双螺旋DNA单链和引物复性DNA变性形式2单链延伸DNA双模板DNA第一轮扩增第二轮扩增第三轮扩增第四轮扩增第五轮扩增PCR中的实时定量PCR通过荧光si实时性别积累。
最后，用标准曲线对未知模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR：对PCR扩增反应终产物进行定量和定性分析。
不可能准确地定量初始模板并实时检测扩增反应。
实时荧光定量PCR：利用实时荧光定量PCR 检测荧光信号在PCR扩增反应各循环中产量的变化，并通过CT值和标准曲线。
rtqpcr原理
rtqpcr原理RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它基于PCR技术，通过测量PCR反应过程中的荧光信号来实时监测DNA或RNA的扩增过程，从而能够准确、快速地定量分析样品中目标基因的表达水平或拷贝数。
本文将详细介绍RT-qPCR的原理及其在科研和临床中的应用。
RT-qPCR的原理主要包括RNA反转录、PCR扩增和荧光信号检测三个步骤。
首先，RNA反转录将RNA转录为cDNA，即反转录过程。
然后，PCR扩增通过DNA聚合酶酶链反应（PCR）使得目标DNA序列在体系中不断复制，从而形成指数级增长。
最后，荧光信号检测通过荧光染料实时监测PCR过程中的DNA合成量，从而得到实时的扩增曲线。
这三个步骤共同构成了RT-qPCR的原理。
RT-qPCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在科研领域，RT-qPCR可以用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。
在基因表达分析中，科研人员可以通过RT-qPCR技术准确地测定目标基因在不同组织或不同处理条件下的表达水平，从而揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
在病原微生物检测中，RT-qPCR可以快速、灵敏地检测样品中的微生物DNA或RNA，对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
在临床领域，RT-qPCR常被用于病毒载量检测、癌症早期诊断、药物代谢鉴定等方面。
例如，临床医生可以利用RT-qPCR技术监测病毒患者血液中病毒载量的动态变化，指导临床治疗方案的调整。
总之，RT-qPCR作为一种准确、快速、灵敏的分子生物学技术，已经成为科研和临床实验室中不可或缺的工具。
它的原理简单清晰，应用广泛多样，为生命科学领域的研究和临床诊断带来了许多便利和突破。
相信随着技术的不断进步和完善，RT-qPCR在未来会有更加广阔的发展前景。
实时荧光定量PCR的应用和进展
实时荧光定量PCR的应用和进展实时荧光定量PCR是一种先进的生物技术，广泛应用于各个研究领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR的应用领域、技术原理、实验流程以及应用前景。
实时荧光定量PCR在许多领域都有广泛的应用，如基因表达研究、病毒检测、基因突变分析、基因克隆和定量分析等。
基因表达研究：实时荧光定量PCR可以用于检测特定基因在不同组织或处理条件下的表达情况，有助于了解基因的功能和调控机制。
病毒检测：实时荧光定量PCR是一种非常灵敏的病毒检测方法，可快速、准确地检测出病毒的复制和含量，对于疫情防控和治疗具有重要意义。
基因突变分析：实时荧光定量PCR结合特异性探针技术，可以用于检测基因突变，对于遗传学研究和疾病诊断具有重要价值。
基因克隆和定量分析：实时荧光定量PCR可以用于基因克隆和定量分析，帮助研究人员了解基因的序列和功能，为基因治疗和药物研发提供支持。
实时荧光定量PCR的技术原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号进行检测和分析。
在PCR扩增过程中，特异性荧光探针与目标DNA序列结合，探针上的荧光基团在特定光源的照射下发出荧光，通过检测荧光信号的强度可以确定目标DNA的含量。
同时，通过对起始模板的定量，可以计算出目标DNA的起始拷贝数。
由于荧光信号的特异性，该技术具有高灵敏度、高准确性和高特异性。
实时荧光定量PCR的实验流程包括以下几个步骤：设计特异性引物和荧光探针：根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光探针，以确保引物和探针能够与目标DNA准确结合。
样品处理：将待测样品进行处理，提取出其中的DNA。
配置PCR反应液：将PCR反应液进行配置，包括dNTPs、Taq酶、特异性引物、荧光探针和DNA模板等。
PCR扩增：在PCR仪中进行扩增，记录每个循环中的荧光信号强度。
数据分析和解释：通过对荧光信号强度的分析和解释，可以得到目标DNA的起始拷贝数和相对表达量。
在设计引物和探针时，要确保其与目标DNA序列的特异性结合，避免非特异性结合造成的误差。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR一、两个概念RT-PCR:国际上约定俗成的是指Reverse transcription PCR（反转录PCR）。
反转录PCR不一定非要与荧光定量相关，从mRNA中反转录得到cDNA，然后PCR扩增出目的基因，这也是反转录PCR。
qPCR：Real-time PCR一般简写为qPCR（quantitative real-time PCR），qPCR除了可以用cDNA 作为模板，也可以用基因组DNA等作为模板。
综上，那RT-qPCR（也有人写成qRT-PCR）就很好理解了，就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从RNA反转录得到cDNA（RT），然后用Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。
二、实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. 荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。
接近一条直线，这样的直线即是基线。
荧光域值（threshold）的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即：threshold = 10*SD cycle 6-15，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1）。
研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。
反之亦然。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。
纵坐标代表CT值。
因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图1. Ct值的确定扩增曲线：PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：①曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
rt—qpcr实验原理及步骤
rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。
其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。
1. 逆转录rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。
逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。
2. PCR扩增在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。
PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。
在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。
3. 实时荧光定量检测在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。
这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。
rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤：1. 样品准备首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、纯化和定量等工作。
样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。
2. 逆转录将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转录反应。
逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。
3. PCR扩增在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。
PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保证扩增反应的特异性和准确性。
4. 荧光定量检测在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针）来进行荧光定量检测。
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在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析 四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
RT-PCห้องสมุดไป่ตู้技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。 • 动物疾病检测：禽流感、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸 膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。 • 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业 阪崎肠杆菌等检测。 • 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 • 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、检验检疫 局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
电泳 PCR
普 通
PCR
在PCR结束后对 终点产物 进行定量分析
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT-PCR技术的数据分析
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
RT-PCR技术的数据分析
3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存 在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存 在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
1. 荧光域值（threshold）的设定