实时荧光定量PCR原理和实验
荧光定量PCR原理与实验流程
林天时 王秋泉 Field Application Scientist 400 820 8982 / 800 820 8982 - 2 - 3 cnmcbsupport@
Life Technologies™ Proprietary | 1
实时荧光定量PCR技术原理
•ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5 6 Proprietary | 54 Life Technologies™ Dye Examples FAM™, SYBR®, SYTO®9 (MeltDoctor™), Fluorescein, SYPRO® Orange VIC®, JOE™, TET™, HEX™ NED™, BODIPY® TMR-X，TAMRA™ ROX™, Texas Red® LIZ™ Alexa Fluor®, Joda-4 Excitation Wave Lenthgh 455~485nm 510~530nm 540~550nm 570~590nm 630~650nm 650~670nm Emission Wave Lenthgh ~520nm ~550nm ~580nm ~620nm ~680nm ~710nm
455~485nm
•7500实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5
Life Technologies™ Proprietary | 52
Dye Examples FAM™, SYBR® VIC®, JOE™ NED™, Cy3，TAMRA™ ROX™, Texas Red® CY5 Dye™
定量PCR如何工作?
• PCR反应液加入了 各种类型的荧光标记物
一个PCR循环
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
实时荧光定量PCR的原理和实验
实时荧光定量PCR的原理及实验不管是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，仍是研究药物对基因表达水平的阻碍，或监控药物和疗法的医治成效，定量pcr技术都能够发挥专门大作用。
定量pcr技术的最新进展是实时荧光定量。
该技术借助于荧光信号来检测pcr产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还能够做到pcr每循环一次就搜集一个数据，成立实时扩增曲线，准确地确信ct值，从而依照ct值确信起始dna拷贝数，做到了真正意义上的dna定量。
这是dna定量技术的一次飞跃。
依照最终取得的数据不同，定量pcr能够分为相对定量和绝对定量两种。
典型的相对定量如比较通过不同方式处置的两个样本中基因表达水平的高低转变，取得的结果是百分比；绝对定量那么需要利用标准曲线确信样本中基因的拷贝数或浓度。
依照所利用的技术不同，荧光定量pcr又能够分为taqman探针和sybr green i荧光染料两种方式。
比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精准；荧光染料技术那么本钱更为低廉，实验设计更为简便。
在选择实验方案时要依如实验目的和对数据精度的要求来决定。
定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以排除偶然误差。
因此重复实验和设立内对照超级重要。
由于各类各样的客观缘故，这一点在实践中往往被轻视或轻忽，需要着重强调。
固然，与定性实验一样，定量pcr也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能显现的问题。
1什么缘故终点定量不准确？咱们都明白理论上pcr是一个指数增加的进程，可是实际的pcr扩增曲线并非是标准的指数曲线，而是s形曲线。
这是因为随着pcr循环的增多，扩增规模迅速增大，taq酶、dntp、引物，乃至dna模板等各类pcr要素慢慢不敷需求，pcr的效率愈来愈低，产物增加的速度就慢慢减缓。
当所有的taq酶都被饱和以后，pcr就进入了平台期。
由于各类环境因素的复杂彼此作用，不同的pcr 反映体系进入平台期的机会和平台期的高低都有专门大转变，难以精准操纵。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
实时荧光定量pcr检测核酸的原理
实时荧光定量pcr检测核酸的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。
RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。
引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。
PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。
每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。
RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。
荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。
荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。
当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。
通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。
RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。
首先，需要从待检测样品中提取出核酸。
然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。
接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。
PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。
PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。
最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。
RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。
实时荧光定量PCR技术原理
实时荧光定量PCR技术原理一、PCR反应：PCR反应是qPCR的关键步骤，它利用DNA聚合酶酶及其附加的DNA 引物扩增靶序列，产生大量特异性放大的DNA片段。
PCR的过程包括三个主要阶段：变性、退火和扩增。
1. 变性（Denaturation）：在94-96℃的高温下，DNA双链解旋为两条单链，使其变性成为模板。
2. 退火（Annealing）：将反应体温降至40-65℃， DNA引物与目标序列的互补部分结合，引物与模板序列的退火温度由其碱基组成决定。
3. 扩增（Extension）：将反应体温升至67-72℃，DNA聚合酶酶依托DNA引物的引导进行DNA链合成，合成一个新的DNA链。
PCR通过不断的循环变性、退火和扩增步骤，每一个循环的两倍增加靶序列的数量，从而迅速放大特定的DNA片段。
二、定量方法：实时荧光定量PCR具有准确、快速、高灵敏度和高特异性的特点，可以定量分析目标序列的初始数量。
qPCR主要通过引入荧光标记和检测体系监测PCR反应的进程，并根据监测到的荧光信号的强弱来确定目标序列的起始浓度。
常用的定量方法包括SYBR Green染料和探针法两种。
1. SYBR Green染料法：这是最常用的定量方法，它利用SYBR Green 染料与DNA结合发出荧光信号。
SYBR Green染料结合到PCR反应中的靶序列上，DNA双链解旋后，SYBR Green染料就可以与靶序列结合，并发出荧光信号。
荧光信号的增加与PCR反应进行的循环次数成正比，荧光信号的曲线由荧光分析仪实时记录，通过建立标准曲线或比较Ct值（Ct，Cycle Threshold，荧光阈值周期，即荧光信号超过背景噪音的最小反应周期数）来确定目标序列起始浓度。
2.探针法：探针法需要合成特异性的探针序列，包含荧光物质和有机磷酸盐类物质。
PCR反应中，探针与靶序列的互补部分结合，作为DNA聚合酶酶的模板，聚合酶在待测的DNA靶序列上进行链合成，荧光小分子物质与酶切开的探针结合发出荧光信号，荧光信号与目标序列的起始浓度成正比。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
简述实时荧光定量PCR技术的原理
简述实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的方法。
它结合了传统的PCR技术和荧光探针技术，可以实时监测PCR反应的进程，并根据荧光信号的强度来确定目标物质的数量。
实时荧光定量PCR的原理如下：
1. PCR反应体系：反应体系中包含目标DNA或RNA模板、引物（一对用于扩增目标序列的寡核苷酸片段）、荧光探针和酶。
荧光探针通常由一个与目标序列互补的序列和一个带有荧光物质和荧光物质猝灭物质的序列构成。
2. 扩增过程：PCR反应通过一系列的温度循环来进行。
首先是变性步骤，将DNA 或RNA模板变性为单链。
然后是退火步骤，引物与目标序列互补结合。
最后是延伸步骤，酶在合适的温度下合成新的DNA链。
3. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列的结合会导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测荧光信号的强度，并记录下来。
4. 分析和定量：通过实时荧光定量PCR系统记录的荧光信号强度曲线，可以确定PCR反应的阈值周期数（CT值）。
CT值表示在达到阈值信号强度时，PCR 反应的循环数。
根据CT值，可以计算出目标序列在初始反应体系中的起始数量。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、突变分析等领域。
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显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量， CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数 越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。正常的CT值范围 在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。
实验方案的设计
根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和 绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理 的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百 分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷 贝数或浓度。
Ct=-klgX0 +b
CT值的确定
Rn（Normalized reporter）:是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光 发射强度的比值。 △Rn:是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn = Rn – 基线）。 基线:在PCR的最初几个循环中，荧光信号是几乎不变的，这确定了扩增图中的基 线。基线范围的定义是从第3个循环起到CT值前3个循环止，一般取第3到第15个 循环之间。在这些初始的循环中，我们看到的其实是反应的荧光背景。 阈值: 用于确定实时定量分析中的CT值的某个△Rn水平。一般将PCR反应前15个循 环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的 10倍，这个水平设定得比基线高，又在扩增曲线的指数增长区域内足够低。 阈值循环（CT）：荧光穿过阈值时的循环数,即阈值与扩增曲线的交叉点。
TaqMan MGB探针
TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通 的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非 荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光， 可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此 为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更 短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在 模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。 实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为 理想。
能计算出起始DNA拷贝数。
荧光定量PCR的优势
在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物 质,随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计， 荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集 一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
实时荧光定量PCR原理 和实验
为什么终点定量不准确？
我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲 线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增 多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种 PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐 减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种 环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平 台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各 种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。
为什么不选普通PCR?
对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测 等,需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷 贝数,经过PCR扩增以后的DБайду номын сангаасA拷贝数已经不能反映真 实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根 据CT值确定DNA起始拷贝的数量。
传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记 后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不 是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板 量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是 利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧 光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号 的强弱就代表了模板的数量。
在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与 模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团 (Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器 检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收， 即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个 同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高 了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收 集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值， 从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义 上的DNA定量。
CT值与模板DNA的关系
一般地，我们有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是说第n次PCR循环时 的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度 (即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。当循环次数n = CT时， 则有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。两边取对数，得log(RT -RB) = logX0 + CTlog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CTlog(1+ Ex) = logX0 + log(RT -RB)–logRs。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为 TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较 而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精 确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。 在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来 决定。
TaqMan探针技术原理